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[背景]
本プロジェクトは、当研究チームが有する高効率のトランスジェニック技術(mII-transgenesis)とRNA干渉法(RNAi)との組み合わせによる新規の遺伝子ノックダウンマウス作成法(tg-directed RNAi)確立を模索するものである。RNAiは、ほとんどの遺伝子に対して適応可能であり、2本鎖RNAがそれに相当するメッセンジャーRNAを目標として破壊することが良く知られている。もし、我々がtg-directed RNAiを確立すれば、ヘミ接合体の作成が可能となり、これは従来よりも有用性の高い遺伝子ターゲティング法になるものと期待される。
[本年度研究実績]
当研究チームでは、ピエゾを用いたマイクロマニピュレーション法による変異マウスの作成を日常的に行ってきた。2003年の10月より当研究チームに所属し、本プロジェクトに携わっている庄司志咲子研究員は、既にこの技術を習得し、現在では、未成熟卵(GV)への短鎖RNA(siRNA)のインジェクションも行えるようになった。
ここで使用するsiRNAは、まず、標的に相当するeGFP融合タンパク質と共にマウスNIH3T3細胞株にて発現させ、そのeGFPタンパク消失の有無を観察することで、その有効性の検証を行ってきた。GVインジェクションおよび細胞株発現系の両実験において、ターゲットに対するRNAiの効果を通常のRT-PCRに加え、さらに定量性のあるリアルタイムRT-PCRによっても確認した。
上述の確認実験により、有効と認められたsiRNAの遺伝子配列は、ショートヘアピン型RNA(shRNA)を発現するようにデザインしたDNAコンストラクトの作成に用いた。このようにして作成したコンストラクトにより、5種類のtgRNAiマウスを作製している。
本研究成果の詳細については、成果報告書にて行うものとする。
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