超好熱菌を利用したin vivo進化によるタンパク質耐熱化システムの開発

2003 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 15350100
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 跡見 晴幸 京都大学, 工学研究科, 助教授 (90243047)
• キーワード: in vivo進化 / 超好熱菌 / 始原菌 / Thermococcus / タンパク質の耐熱化 / 熱安定性 / 分子進化 / Directed evolution

研究概要

今年度はまず超好熱始原菌Thermococcus kodakaraensis KOD1株を利用したin vivo進化を進める際に必要となる様々な宿主細胞・ベクターの構築を進めた。外来遺伝子のゲノム上の導入場所としてはchitin分解系遺伝子群のlocus(chitinase locus)を選んだ。本遺伝子群はchitin資化時にのみ転写され、生命に必須でないことが確認されているからである。また、複数の遺伝子が同時に導入できるよう、ΔtrpE,ΔpyrFの二重破壊株を作製した。本研究では熱安定性の低いタンパク質が変性し、不溶性タンパク質が細胞内に蓄積することにより生育阻害が引き起こされるという選択圧を採用しているため、生育阻害が顕著であればあるほど、screeningが容易となる。そのために細胞内不要タンパク質の分解を司るLon proteaseの遺伝子破壊を試みた。その結果、Δlon破壊株の単離に成功し、本遺伝子が生命維持に必須でないことが判明した。Δlon破壊株の形質としては膜画分における一部のタンパク質の蓄積が観察された。
必要となる宿主細胞・ベクターが全て構築できたので、常温生物由来の数種の遺伝子を含み、chitinase locusにおけるdouble crossover組換えが起こるようなベクターの構築を行った。選択markerにpyrF遺伝子を用い、外来遺伝子のpromoterにはglutamate dehydrogenase(GDH)promoterを利用した。GDHはKOD1株内で最も強力なpromoterの1つである。既にウラシル非要求性の形質転換体を得ているのでそれらの解析を進めている。

研究成果

• [文献書誌] H.Atomi, T.Fukui, T.Kanai, M.Morikawa, T.Imanaka: "Description of Thermococcus kodakaraensis sp. nov., a well studied hyperthermophilic archaeon previously reported as Pyrococcus sp.KOD1"Archaea. 1・4(in press). (2004)
• [文献書誌] T.Kanamori, N.Kanou, H.Atomi, T.Imanaka: "Enzymatic characterization of a prokaryotic urea carboxylase"J.Bacteriol.. 186・9(in press). (2004)
• [文献書誌] T.Amo, H.Atomi, T.Imanaka: "Biochemical properties and regulated gene expression of the superoxide dismutase from the facultatively aerobic hyperthermophile pyrobaculum calidifontis"J.Bacteriol.. 185・21. 6340-6347 (2003)
• [文献書誌] T.Tanaka, T.Fukui, H.Atomi, T.Imanaka: "Characterization of an exo-β-D-glucosaminidase involved in a novel chitinolytic pathway in Archaea"J.Bacteriol.. 185・17. 5175-5181 (2003)
• [文献書誌] T.Sato, Toshiaki Fukui, H.Atomi, T.Imanaka: "Targeted gene disruption by homologous recombination in the hyperthermophilic archaeon Thermococcus kodakaraensis KOD1"J.Bacteriol.. 185・1. 210-220 (2003)
• [文献書誌] 跡見晴幸, 今中忠行: "超好熱菌の高温環境適応戦略"生化学. 75・7. 561-575 (2003)