| 研究課題/領域番号 |
15370004
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
石浦 正寛 名古屋大学, 遺伝子実験施設, 教授 (20132730)
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| 研究分担者 |
九町 健一 名古屋大学, 生命農学研究科, 学術振興会研究員
井原 邦夫 名古屋大学, 遺伝子実験施設, 助手 (90223297)
杉山 康雄 名古屋大学, 遺伝子実験施設, 助教授 (70154507)
加藤 博章 京都大学, 大学院・薬学研究科, 教授 (90204487)
難波 啓一 大阪大学, 大学院・生命機能研究科, 教授 (30346142)
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| キーワード | 生物時計 / 藍色細菌 / 時計タンパク質 / DNAマイクロアレイ / 発光レポーター遺伝子 / X線結晶構造解析 |
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| 研究概要 |
55℃でも機能する耐熱性カナマイシン耐性遺伝子km_<Te>を開発し、好熱性藍色細菌Thermosynechococcus elongatusのゲノムへの効率的な遺伝子移入系を構築した。そして、高温条件下でも機能する生物発光測定装置と耐熱性ルシフェラーゼ遺伝子2種類(Xl luxABとLUC^+_<Te>)を開発し、psbAl、kaiA、kaiBC遺伝子のプロモーター活性を生物発光リズムとしてリアルタイム測定し、T.elongatusが概日リズムを持つことを証明した。T.elongatusでは常温性藍色細菌と同様にkaiABC遺伝子群が時計本体であり、その発現制御も同じであることを示した。
T.elongatusの全遺伝子を網羅するオリゴアレイを作製するため、各遺伝子について、(1)ゲノムの他の遺伝子に対して70%以上の相同性を示さない、(2)GC含量が35〜55%、(3)Tを22%以上含まない、(4)分子内で安定な2次構造をとらない(自由エネルギーが-10.5 kcal/mol以上)、(5)繰り返し配列を含まない、という5つの条件を満たすオリゴDNAの検索を行った。これらのオリゴDNAを用いて実際にオリゴアレイを作製した。本アレイは遺伝子特異性、定量性ともに高いことを確認した。
X線結晶構造解析により、KaiA C末端時計発振ドメインとKaiBの立体構造を決定した。立体構造及び11種の藍色細菌の各Kaiタンパク質のアミノ酸配列の比較から、時計発振機能に重要と思われる残基を予想し、一アミノ酸置換変異を導入した。変異株をin vivo、in vitroで解析することで、KaiA二量体の曲面がKaiCとの結合領域であり、その最深部に位置するHis270が時計発振機能に必須な残基であることを決定した。またKaiB四量体のnegative ridgeとpositive cleftが時計発振機能に重要な領域であることを決定した。
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