改変PEPC遺伝子導入植物の作出を目指したC4光合成酵素の構造生物学

2003 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 15370045
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 甲斐 泰 大阪大学, 大学院・工学研究科, 教授 (40029236)
• 研究分担者: 松村 浩由 大阪大学, 大学院・工学研究科, 助手 (30324809) ; 金久 展子 大阪大学, 大学院・工学研究科, 講師 (20177538) ; 井上 豪 大阪大学, 大学院・工学研究科, 助教授 (20263204)
• キーワード: C4植物 / トウモロコシ / 炭酸固定酸素 / PEPカルボキシラーゼ / 活性調節因子 / PEPC-Protein Kinase / X線構造解析 / 分子機構解明

研究概要

ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(PEPC)は、C4植物とCAM植物の光合成組織においては光合成の初期炭酸固定酵素として、またこれらの植物の非光合成組織およびC3植物においては細胞内の炭素代謝と窒素代謝のバランスを決定する鍵酵素である。その酔素活性は、PEPCに特異的なリン酸化酵素(PEPC-PK)による分子内リン酸化や様々な活性調節因子(リンゴ酸など)によって調節される。PEPCをイネに高発現させることによって、炭酸固定効率が増大し、光合成の酸素阻害が低減されるとの報告もあり、PEPCの活性調節に関わるメカニズム解明が待たれている。我々は、植物の炭酸固定の分子機構と活性調節機構の全容を明らかにする目的で以下の研究を行った。
まず、C4植物のトウモロコシ由来PEPCについてその立体構造の解析を進め、大腸菌由来PEPCの立体構造比較を行った。我々の構造解析したトウモロコシ由来PEPCは活性型の構造を示しており、大腸菌由来PEPCはフィードバック阻害因子が結合した不活性型の構造と比較することによって、PEPCのアロステリック活性調節機構を初めて明らかにし、論文1報と総説2報に報告した(Structure10,1721-1730(2002),Arch.Biochem.Biophys.414,170-179(2003),Annual Review Plant Biol.(2004)in press.)。
更に、我々は、トウモロコシ由来NADP依存型リンゴ酸酔素の精製・結晶化に取り組んだ。0.1mm程度の大きさの結晶を作成することに成功し、5.0Å分解能の回折能を示す結晶を得ている。現在、結晶の質およびサイズの改良を目指して、我々が新しく開発した溶液状態制御による結晶化を行っている(Jpn.J.Appl.Phys 43,L79-L81(2004))。
また、PEPCを特異的に認識するリン酸化酵素(PEPC-PK)については、フラベリア由来PEPC-PKの大量培養および精製方法の確立に成功し、微結晶を得ており、今後更なる結晶化条件の精密化を行う予定である。
また、イネ由来Rubiscoについては、Rubiscoで初めてNADPHによる活性化促進の分子メカニズムを明らかにすることに成功し、現在論文投稿準備中である。

研究成果

• [文献書誌] Y, Kai, et al.: "Phosphoenolpyruvate carboxylase : Three-dimensional structure and molecular mechanisms"Arch.Biochem.Biophys.. 414. 170-179 (2003)
• [文献書誌] Izui, K.: "Phosphoenolpyruvate carboxylase : Three-dimensional structure and molecular mechanisms"Annual Review Plant Biol.. (in press). (2004)
• [文献書誌] Inoue, T.: "The First Determination of the Inhibitor Complex Structure of Human Hematopoietic Prostaglandin D Synthase"J.Biochem.. (in press). (2004)
• [文献書誌] Adachi, H.: "Two-liquid hanging-drop vapor-diffusion technique of protein crystallization"Jpn.J.Appl.Phys.. 43. L79-L81 (2004)
• [文献書誌] Inoue, T.: "Mechanism of metal activation of human hematopoietic prostaglandin D synthase"Nature Structural Biology. 10. 291-296 (2003)
• [文献書誌] Inoue, T.: "ヒト由来プロスタグランジンD合成酵素の金属イオン効果のメカニズム"日本結晶学会誌. 45. 190-195 (2003)
• [文献書誌] Inoue, T.: "The significance of the flexible loop in the azurin (Az-iso2) from the obligate methylotroph Methylomonas sp.strain J."J.Mol.Biology. 333. 117-124 (2003)
• [文献書誌] Yamamoto, T.: "Crystallization and preliminary X-ray analysis of TBP-interacting protein from the hyperthermophilic archaeon Thermococcus kodakaraensis strain KOD1"Acta Cryst.. D59. 372-374 (2003)
• [文献書誌] Adachi, H.: "Laser Irradiated Growth of Protein Crystal"Jpn.J.Appl.Phys.. 42. 798-800 (2003)
• [文献書誌] Adachi, H.: "New practical technique for protein crystallization with floating and stirring methods"Jpn.J.Appl.Phys.. 42. L1161-L1163 (2003)
• [文献書誌] Xieyong. Y.: "Crystallization and preliminary X-ray crystallographic studies of mavicyanin from Cucurbita pepo medullosa"Acta Cryst.. D59. 1474-1476 (2003)