| 研究課題/領域番号 |
15370045
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
構造生物化学
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
甲斐 泰 大阪大学, 大学院・工学研究科, 教授 (40029236)
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| 研究分担者 |
井上 豪 大阪大学, 大学院・工学研究科, 助教授 (20263204)
金久 展子 大阪大学, 大学院・工学研究科, 講師 (20177538)
松村 浩由 大阪大学, 大学院・工学研究科, 助手 (30324809)
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| 研究期間 (年度) |
2003 – 2004
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| キーワード | C4植物 / ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ / 活性調節メカニズム / 構造-機能相関 / NADP依存型リンゴ酸酵素 / PEPC-PK / PEPC変異体K620S |
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| 研究概要 |
本研究では、C4植物に特徴的な酵素であるホスホスノールピルビン酸カルボキシラーゼ(PEPC)のin vitro活性調節機構を解明することを目的として、PEPCに元来備わっている活性調節の分子機構解明に加えて、PEPCの活性調節に関与する同じ代謝系の酵素群の機能を構造科学的に解明することを目的とした。
まず、アロステリック阻害剤であるリンゴ酸に阻害を受けない大腸菌由来酵素変異体K620Sの立体構造解明を目的として、酵素を大量発現し結晶化を行った。その後、放射光施設Spring-8にて回析強度データ収集を行い、3.0Å分解能までのデータを収集した。続いて、分子置換法により構造解析を行い、アロステリック阻害剤脱感作の分子機構を明らかにした。現在、研究成果のとりまとめを行っている。
次に、PEPCの活性調節に重要な役割を担っているPEPCに特異的なリン酸化酵素(PEPC-PK)の立体構造解明を目的とし、本酵素の大量発現・精製・結晶化を行った。微結晶は得られたものの残念ながらX線構造解析に適した単結晶は得られておらず、引き続き精製・結晶化を行っている。
続いて、PEPCの阻害剤であるリンゴ酸を基質とするNADP依存型リンゴ酸酵素(NADP-ME)の構造-機能相関解明を目的とし、本酵素の大量発現・精製・結晶化を行った。単結晶を得ることが非常に困難であったが、SPring-8にて3.0Å分解能の回析強度データを収集することに成功した。現在、立体構造解析に取り組んでいる。
更に、本研究では、立体構造情報を元に生化学者と共同でPEPC変異体を作成し、詳細なPEPC活性調節メカニズムにおける構造-機能相関を解明した。これらの成果に加えて、本研究では数種類のタンパク質を扱い結晶化を行う過程で、溶液状態制御による新しい結晶化手段を考案し、これら新規手法が良質のタンパク質結晶成長に有効であることを明らかにした。
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