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小胞体ストレスセンサータンパク質の一つであるIREの細胞内ドメインの構造を決定して、ストレス感知直後のシグナル伝達のメカニズムの構造的基盤を構築するために、本年度はタンパク質発現系の構築と結晶化グレードのタンパク質精製を目指して、実験を推進した。
IRE1としては、IRE1βのほかに、IRE1αとIre1pも同様に用いる。IRE1の細胞質ドメインには、細胞膜直下から、リンカー領域、タンパク質キナーゼドメイン、RNaseドメイン、そして、C-末端側にテール領域がある。どのようなコンストラクトがタンパク質の発現量が多く、高度の精製が可能で、かつ、最難関である結晶化が迅速に実現するかは、今の段階ではわからないので、N-末端側からと、C-末端側から領域やドメインを順次削ったコンストラクトを3種類のIRE1について作成して、発現をチェックした。発現ホストとして大腸菌と昆虫細胞を用いて、様々な発現ベクターを試した結果、発現するのものもあったが、ほとんどの発現タンパク質は不溶性となった。それらの巻き戻し実験も効を奏さなかった。そこで、可溶性タンパク質の割合が比較的多かったゴンストラクト(Ire1p)を用いて大量発現(2-3L)を試みて、タンパク質が精製可能か、不安定でないかなどをテストした結果、精製できることがわかた。
TRAF2については、C-末端側にあるTRAF保存領域がTNFやIRE1との結合に用いられていることがわかっており、他のグループの実験よりタンパク質も可溶性になることがわかっているので、この部分のコンストラクトを構築して、発現・精製した。
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