研究課題
小胞体ストレスセンサータンパク質の一つであるIREの細胞内ドメインの構造を決定して、ストレス感知直後のシグナル伝達のメカニズムの構造的基盤を構築することを目的とした。IREはI型膜タンパク質であり、哺乳類細胞にはIREαとIREβがあるが、酵母はIre1pのみである。IRE1の細胞内ドメインはセリン・スレオニンタンパク質キナーゼドメインとRNaseドメインをもち、活性化時に、自己リン酸化とともにRNaseが活性化して、RNAの分解によるストレス応答シグナルを伝達する。このようなタンパク質キナーゼドメインを通してRNase活性を制御するという例は他の受容体にはなく、IRE1は全く新規なシグナル伝達の制御機構をもっている点に注目した。本年度は、前年度に検討したタンパク質発現系のうち、有望なものに焦点を絞って実験を推進した。IRE1としては、IRE1β、IRE1αと、ならびにIre1pを用いて、発現系の検討を進めてきたが、IRE1の細胞質ドメインは、細胞膜直下から、リンカー領域、タンパク質キナーゼドメイン、RNaseドメイン、そして、C-末端側にテール領域をもつが、様々なドメイン構成の発現系の中でも、Ire1pのタンパク質キナーゼドメインとRNaseドメインを含むコンストラクトで比較的良好なタンパク質発現を認めたので、大量発現(2-3L)を試みて、タンパク質が精製可能か、不安定でないかなどをテストした。その結果、精製タンパク質を得ることに成功した。IRE1の細胞外(小胞体内)ドメインについても、発現と精製の検討を行い、精製可能なコンストラクトを見出した。今後、結晶化や精製を鋭意続行する。また、必要であれば、更に上記のコンストラクトをもとに、タンパク質の発現量が多く、高度の精製が可能で、かつ、最難関である結晶化が迅速に実現するようなコンストラクトになるように改良を加える。
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