発生工学プロテオミクスを用いたPKC-δシグナル伝達系の解明

2003 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 15370060
• 研究機関: 九州大学
• 研究代表者: 中山 敬一 九州大学, 生体防御医学研究所, 教授 (80291508)
• 研究分担者: 嘉村 巧 九州大学, 生体防御医学研究所, 助教授 (40333455) ; 畠山 鎮次 九州大学, 生体防御医学研究所, 助教授 (70294973) ; 中山 啓子 東北大学, 大学院・医学系研究科, 教授 (60294972) ; 谷内 一郎 九州大学, 生体防御医学研究所, 助手 (20284573)
• キーワード: 発生工学 / プロテオミクス / シグナル伝達 / リン酸化 / 質量分析 / 翻訳後修飾 / PKC-δ / ノックアウトマウス

研究概要

タンパク質の生物学的機能をとらえる最も有効な手段として、発生工学的手法を用いて作製した遺伝子改変マウスの解析が挙げられる。本研究では、遺伝子改変によって生ずるマウスタンパク質の総体的な変化をプロテオミクス技術によって網羅的に検索するシステム「発生工学プロテオミクス」を構築し、それによって多くの酵素-基質関係を同定することによって種々のシグナル伝達系の総合的理解を目指す。そのために、まずわれわれが作製したPKC-δノックアウトマウスを用いて、シグナル伝達分子のリン酸化レベルを網羅的に検討するシステムを構築した。リン酸化プロテオーム解析に関しては、リンパ球を刺激した状態と未刺激の状態のタンパク質を抽出し、抗リン酸基抗体を用いたアフィニティー精製によって基質分子を選択的に精製し、液体クロマトグラフィーとイオントラップ型質量分析計を組み合わせたLC-MS/MSを用いてショットガン解析することで、300種類以上のタンパク質の同定に成功している。さらに一部の基質分子に関してはリン酸化部位の同定が可能であった。さらに、安定同位体(^<13>C)を含むアミノ酸(ロイシン)を培地中に加えることによって、加えていない資料を対照として、その比較から二つの状態における同一タンパク質の比較定量が可能となる。この原理に基づき、刺激の有無によるリン酸化タンパク質の変化を網羅的に定量する方法を確立することを行った。その結果、シグナル伝達に関わる多くのリン酸化タンパク質が実際に抗原刺激等の有無でかなり変動することが確認された。

研究成果

• [文献書誌] Nakayama, K., et al., Nakayama, K.I.: "Impaired degradation of inhibitory subunit of NF-κB (IκB) and β-catenin as a result of targeted disruption of the β-TrCP1 gene"Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 100(15). 8752-8757 (2003)
• [文献書誌] Kamura, T.et al., Nakayama, K.I.: "Degradation of p57^<Kip2> mediated by SCF^<SKp2>-dependent ubiquitylation"Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 100(18). 10231-10236 (2003)
• [文献書誌] Imaki, H.et al., Nakayama, K.I: "Cell cycle-dependent regulation of the Skp2 promoter by GA-binding protein"Cancer Res.. 63(15). 4607-4613 (2003)
• [文献書誌] Tsunematsu, et al., Nakayama, K.I.: "Mouse Fbw7/Sel-10/Cdc4 is required for notch degradation during vascular development"J.Biol.Chem.. 279(10). 9417-9423 (2004)
• [文献書誌] Matsumoto, M., et al.Nakayama, K.I.: "Molecular clearance of ataxin-3 is regulated by a mammalian E4"EMBO J.. 23(3). 659-669 (2004)
• [文献書誌] Ohtsuka, T., et al., Nakayama, K.I., Lee, S.W.: "ASC is a Bax adaptor and regulates the p53-Bax mitochondrial apoptosis pathway"Nature Cell Biol.. 6(2). 121-128 (2004)