| 研究課題/領域番号 |
15380008
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| 研究機関 | 基礎生物学研究所 |
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研究代表者 |
寺田 理枝 基礎生物学研究所, 分子遺伝学研究部門, 助手 (30137799)
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| 研究分担者 |
栂根 一夫 基礎生物学研究所, 分子遺伝学研究部門, 助手 (50343744)
飯田 滋 基礎生物学研究所, 分子遺伝学研究部門, 教授 (30012777)
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| キーワード | イネ / 遺伝子ターゲティング / アルコール脱水素酵素 / ゲノム改変 / T-DNA / 相同組換え / Cre / loxP / 部位特異的組換え |
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| 研究概要 |
イネ遺伝子ターゲティングをポストゲノム時代のゲノム改変法として、内在性遺伝子改変に広く応用できるシステムとして完成させることを目的とし、第11番染色体に4コピーの重複遺伝子として見いだされているアルコール脱水素酵素(Alcohol dehydrogenase : Adh)遺伝子のAdh1とAdh2についてのターゲティングを進めた。Adh1で4系統、Adh2で9系統の独立の棯性のあるターゲットイネ植物系統を得た。T0、T1世代のサザン解析で、すべての系統で、正確な2回の相同組換えによるターゲティングが生じていることが明らかとなった。ターゲティングの頻度はAdh1とAdh2で異なり、強力なポジティブ-ネガティブ選抜された生存カルスに対するターゲティングカルスは、Adh1で0.16%、Adh2で1.9%であり、Waxyターゲティングの0.9%の効率が、特殊な組換えによるものではなく、イネターゲティング法は内在性の種々の遺伝子改変に応用できると考えられる。Adh1とAdh2のターゲット領域はすべてヘテロ型で、次世代でターゲットホモ、ヘテロ野生型の分離植物が得られた。Adh1ターゲットホモ植物で冠水中の発芽種子の生長抑制が観察された。Adh2のターゲットホモ植物では、幼少植物の根でAdh2の転写抑制をRT-PCRで確認した。さらに、Adh1のターゲティングではベクターに用いる相同組換えの長さを従来の半分の3kbまで短縮できることを見出し、ベクター構築や相同組換えカルスの検出が簡便かつ効果的に行えることが明らかとなった。また本課題ではベクターに用いた相同領域をすべてPCR増幅で得たため、これらの領域に多型が生じていたが、これらの多型はターゲティングの系統別に異なってゲノムに持ち込まれていることがわかり、T-DNAを介したイネの相同組換えの機構解明の有効な知見を得ることができた。また、Cre/loxPの部位特異的組換えサイトをポジティブマーカーと転写終止の挿入領域の両端に組み込み翻訳開始のON/OFFを行える遺伝子発現制御スイッチについてWaxyターゲティングホモ個体のカルスを用いてCreの一過的発現を行ったところ、2系統についてターゲット挿入領域が削除されたと推定される個体を得た。
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