糸状菌の液胞生理機能の分子細胞生物学的解析

2003 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 15380058
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 北本 勝ひこ 東京大学, 大学院・農学生命科学研究科, 教授 (20272437)
• キーワード: コウジカビ / 液胞 / A.oryzae / EGFP / 麹菌 / vps変異株 / SNARE / V-ATPase

研究概要

液胞は糸状菌細胞でもっとも大きなオルガネラであり、代謝産物の貯蔵、細胞質イオン恒常性の維持、生体高分子の分解、再利用などの機能をもつ。また、細胞伸張、先端生長、タンパク質分泌、外界のpH感知等にも密接な関連をもつと推定されている。本研究は、糸状菌における液胞の機能を分子レベルで解析を行うことを目的として行った。まず、麹菌の液胞形態の可視化、液胞のダイナミックな動態の解析のための基本的なツールとして、Aovam 3 (VAM3ホモログ)、Aovma3 (VMA3ホモログ)、Aovps10 (VPS10ホモログ)の3遺伝子を単離した。液胞膜SNAREと推定されるAovam 3とEGFPとの融合遺伝子を作成して、共焦点レーザー顕微鏡により観察したところ、細胞部位による液胞形態の差異、生きた細胞で液胞膜がダイナミックに融合、分裂する様子が観察された。V-ATPaseのサブユニットであるAovma3とのEGFP融合遺伝子の発現では、液胞膜の他にERと思われる部位に蛍光が観察された。Aovam 3遺伝子の発現を抑制することにより、液胞形態には大きな変化はなかったが、気中菌糸形成に阻害が認められた。Aovps10遺伝子破壊により、液胞内カルボキシペプチダーゼ(CPY)の液胞への輸送に欠損が認められた。
また、cpyA-EGFP融合遺伝子発現株(液胞に蛍光が観察される)を親株として、蛍光が培地中にミスソートする変異株を多数取得した。これらの中には、培地のpHにより、菌糸の形態が大きく変化する株が複数含まれていた。得られた変異株にコスミドライブラリーを導入することにより、変異遺伝子の同定を試みた。

研究成果

• [文献書誌] K.Masai, J.Maruyama, H.Nakajima, K.Kitamoto: "In vivo visualization of the distribution of a secretory protein in Aspergillus oryzae hyphae using the RntA-EGFP fusion protein"Biosci.Biotech.Biochem.. 67. 455-459 (2003)
• [文献書誌] I.Matsumoto, S.Kim, Y.Yamamoto, K.Ajisaka, J.Maruyama, H.Nakajima, K.Kitamoto: "Cloning and overexpression of β-N-acetylglucosaminidase encoding gene nagA from Aspergillus oryzae and enzyme-catalyzed synthesis of human milk oligosaccharide"Biosci.Biotech.Biochem.. 67. 646-650 (2003)
• [文献書誌] J.Maruyama, H.Nakajima, K.Kitamoto: "Novel role of cytoplasmic dynein motor in maintenance of the nuclear number in conidia through organized conidiation in Aspergillus oryzae."Biochem.Biophys.Res.Commun.. 307. 900-906 (2003)
• [文献書誌] FJ.Jin, J.Maruyama, PR Juvvadi, M.Arioka, K.Kitamoto: "Adenine auxotrophic mutants of Aspergillus oryzae : development of a novel transformation system with triple auxotrophic hosts Isolation of adenine auxotrophic mutants from A.oryzae"Biosci.Biotechnol.Biochem.. 68(in press). (2004)
• [文献書誌] M.Oka, J.Maruyama, M.Arioka, H.Nakajima, K.Kitamoto: "Molecular cloning and functional characterization of avaB, a gene encoding Vam6p/Vps39p-like protein in Aspergillus nidulans."FEMS Microbiol.Letters. (in press). (2004)