| 研究課題/領域番号 |
15380064
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
応用微生物学
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
原島 俊 大阪大学, 大学院・工学研究科, 教授 (70116086)
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| 研究分担者 |
西沢 正文 慶応義塾大学, 医学部, 講師 (20218150)
金子 嘉信 大阪大学, 大学院・工学研究科, 助教授 (90161182)
杉山 峰崇 大阪大学, 大学院・工学研究科, 助手
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| 研究期間 (年度) |
2003 – 2005
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| キーワード | 出芽酵母 / ゲノム工学 / 染色体工学 / 染色体分断 / 細小ゲノム酵母 / リボソームDNA / 寿命 / サイレンシング |
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| 研究概要 |
本研究では、細小ゲノムを持つ出芽酵母細胞を創製することを最終的な目的として、大規模にゲノムを操作できる新しいゲノム工学技術の開発を行った。出芽酵母では、細胞分裂に際し、サイズの小さいミニ染色体は、染色体の分配異常によって娘細胞に正確に分配されないことが知られている。この現象を利用して、小さく分断したミニ染色体を持つ細胞を、それぞれの目的た応じた条件下で培養すれば、その条件下で必要な分断ミニ染色体は選択圧により保持され、不必要なミニ染色体は脱落することが期待される。こうしたストラテジーによって、これまで不可能であったゲノムの再構築が可能になると考えた。この事を実証するため、まず、PCRを利用して、染色体を簡便に、しかも効率良く分断する技術(PCR-mediated chromosome splitting)を開発した。次に、この技術を用いて、16本の染色体を持つ出芽酵母一倍体株のいくつかの染色体を繰り返し分断し、3系統の分断株、M1、M2、M3を作製した。M1株は染色体数が43本で脱落可能領域が14箇所、M2株は染色体数が30本で脱落可能領域を7箇所、またM3株は染色体数が31本で脱落箇所が10箇所持つ。これらの株を栄養培地で培養することによって染色体の自然脱落を誘導し、その脱落パターンを解析した結果、予想通り、多様なゲノム組成を持つ株を作製できることがわかった。また、複製起点を持っていない染色体領域を人工染色体化するため、分断と同時に複製能を導入できるさらに高度な分断技術の開発も行った。ヒストンH4遺伝子の近傍にあるARS配列(H4ARS)を連結した鋳型プラスミドを作成し、PCRによって分断用断片を調製した。これらの断片を用いて分断を行った結果、ARSを持たない染色体領域でも、ミニ人工染色体化できることがわかった。さらに、出芽酵母rDNAが関与する細胞生理の解析に染色体分断技術の応用し、rDNAが関与する細胞生理に第XII番染色体の構造が重要な役割を果たしている事を明らかにした。
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