| 研究課題/領域番号 |
15380074
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| 研究機関 | 佐賀大学 |
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研究代表者 |
渡邉 啓一 佐賀大学, 農学部, 教授 (40191754)
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| 研究分担者 |
本島 浩之 佐賀大学, 農学部, 助手 (20312275)
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| キーワード | 低温適応酵素 / 乳酸デヒドロゲナーゼ / 酢酸キナーゼ / 結晶構造 / Trematomus bernacchii / Pseudoalteromonas / 好冷細菌 |
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| 研究概要 |
酵素構造の柔軟性と低温活性発現との関係について明らかにすると共に、低温活性向上のためのタンパク質工学的戦略を確立することを目的として研究を進めた。サチライシンに対して計画的でかつ網羅的な変異体解析を行うために、部位指定変異と発現分泌が容易に行える大腸菌-枯草菌-酵母シャトルベクターを構築した。また、L-乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)の構造と低温適応について検討した。
1.大腸菌-枯草菌-酵母シャトルベクターの構築とタンパク質工学的利用
大腸菌-枯草菌シャトルベクターpHY300PLKに、酵母の複製起点(2μ origin)と選択マーカー(URA3)、枯草菌由来α-アミラーゼのプロモーター及びシグナル配列領域を挿入し、大腸菌-枯草菌-酵母シャトル発現分泌ベクターpEBY-amyR1-sigを構築した。このベクターのシグナル配列下流にサチライシンをコードするDNAを酵母相同組換えにより連結し、得られたプラスミドで枯草菌を形質転換した結果、組換えサチライシンを発現分泌した。さらに、本ベクターを用いて、酵母相同組換えによりサチライシンへの部位指定変異の導入が容易にかつ効率よくできた。
2.LDHの構造と低温適応
南極産魚類ショウワギス(Trematomus bernacchii)骨格筋LDHのアミノ酸配列はコイLDHと85%一致している。そこで、LDHの構造と低温適応との関係を明らかにすることを目的として、コイLDHと基質アナログ(オキサム酸)との複合体の結晶構造を分解能3.0Åで明らかにした。コイLDHの立体構造を基に両酵素のアミノ酸配列を比較した結果、コイLDHの分子表面に位置しているAla79、Lys222、Lys224、Ser237が昭和ギスLDHではGlyに置換していた。これらのGlyへの変異が昭和ギスLDHの低温活性に必要な構造のゆらぎに関与している可能性が示唆された。
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