| 研究課題/領域番号 |
15380136
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| 研究機関 | 日本大学 |
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研究代表者 |
中西 照幸 日本大学, 生物資源科学部, 教授 (00322496)
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| 研究分担者 |
杣 源一郎 徳島文理大学, 健康科学研究所, 教授 (00158990)
吉浦 康寿 養殖研究所, 病害防除部, 研究員 (90372052)
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| キーワード | ニジマス / ゼブラフィッシュ / アユ / TNFα / トランスジェニック / GFP / mRNA発現 / 組み換えTNF |
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| 研究概要 |
1.感染・発病に伴うTNFの発現解析
ニジマスTNF1及びTNF2のプロモーター下流にGFP遺伝子を組み込んだトランスジェニック(TG)ニジマスについて10系統以上のラインを確立した。それらの各系統について病原体に対する腎臓白血球の包囲化試験を行った結果、いくつかの系統において包囲化した白血球の一部にGFP陽性反応が認められた。
2.個体発生に伴うTNF mRNAの発現解析
前年度に単離・同定したゼブラフィッシュの2種類のTNF-αについて、ゼブラフィッシュ胚における発現動態をwhole-mount in situ hybridization法により調べた結果、2種類のTNFとも胚発生の初期(中期胞胚期以前)において陽性反応が認められた。これは2種類のTNF-αとも母性由来のRNAとして存在していることを示していた。その後、発生の進行に伴って、脳、神経系での弱い発現が認められたが、明瞭な局所発現は認められなかった。また、2種類のTNF-αに発現動態に明確な違いは認められなかった。
また、アユの受精卵を用いて各発育段階毎のTNF mRNAの発現解析をリアルタイムPCR法により解析したところ、発生に伴いTNFの誘導が起こり孵化時には低下する一過性の発現が認められた。
3.アユTNF組み換えタンパクの作製及び機能解析
アユTNFαについては、pColdTFベクターとシャペロンタンパク発現大腸菌を用い、低温誘導により総可溶性タンパク質のほぼ50%にあたる量の組換え体発現に成功した。得られたTF/アユTNF融合タンパク質をHis-tagを利用して精製し、さらにHRV3Cで切断した後、ポリアクリルアミドゲルから回収することにより精製した。精製アユTNFの機能について解析した結果、アユ頭腎細胞からの活性酸素誘導能があることが示された。
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