| 研究概要 |
今年度はMMPの阻害剤である1,10-フェナントロリンを生きたマダイに注射し,死後の筋肉物性に与える影響を調べた.その結果,MMP活性を阻害することで有意に死後の軟化が抑制されたことから,筋肉の軟化現象にMMP関与が示唆された.この結果を受け,マダイTIMPを過剰に強制発現させた遺伝子組換えマダイの作出に着手した.発現ベクターを構築するに当たり,遺伝子組換え魚の社会的な受容を考慮して,マダイTIMP-2のcDNAとマダイ筋肉アクチンプロモーターを結合し、マダイ以外の遺伝子を一切含まないマダイ専用の筋肉特異的発現ベクターを構築した.TIMP-2の代わりに,レポーター遺伝子として緑色蛍光タンパク質GFPを導入したマダイにおいて,筋肉組織に特異的なGFPの発現が確認されたことから,本ベクターは筋肉特異的誘導活性を有することが示された.筋肉アクチンプロモーターについては,上流域については1285bpと3053bpの2種類について,ポリA付加シグナルを含む下流域については153bpと1154bpのものに加え,SV-40由来のものについても検討した.しかし,GFPの発現活性や致死率,孵化率において各コンストラクト間に有意な違いは認められなかった.もっとも長い筋肉アクチンの上流,下流を含むベクターをジーガンによりマダイ受精卵(1細胞期)に導入し,その発現をF0魚で検討したが,GFPの発現は確認されなかったことから,マダイにおいてジーンガンは適切な遺伝子導入ではないと判断された.そこで,従来どおり,マイクロインジェクションによりTIMP遺伝子導入を行うこととした.
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