| 研究概要 |
1、繊維形成測定法の開発
トリチウム標識ロイシンを含んだRPMI培養液で顆粒膜細胞を培養すると,トリチウムで標識されたZPCが細胞外へ分泌されるが,この状態では水溶性タンパクとして培養液に溶けていることを確かめた。次にこのZPCがZP1と会合してインビトロで繊維を形成する過程をトリチウムをトレーサーとして経時的に測定する方法を確立した。
2、分泌動態の観察
トリチウム標識ロイシンを含んだ培養液で顆粒膜細胞を培養し,分泌に関する各種阻害剤を添加して,粗面小胞体,ゴルジ体,分泌顆粒,分泌小胞に貯留されたZPCおよびZPC前駆体の量をオートラジオグラフィーおよび免疫組織化学によって観察した。
3、ZP1とZPCの大量発現
様々な点変異(site-directed mutagenesis)により改変したZP1遺伝子およびZPC遺伝子をCHO細胞にトランスフェクションし,N-結合またはO-結合糖鎖不含,N末端またはC末端ペプチド欠損,膜貫通領域欠損,プロセッシング酵素耐性などの変異タンパクを作製した。各種変異タンパクの分泌量を免疫沈降法によって定量するとともに,大量発現によってタンパクを効率良く回収することに成功した。
4、今後の研究の展開
新たに開発した繊維形成測定法によってZP1とZPCの会合の程度を測定することができるようになったので,さまざまな点変異ZP1およびZPCの会合の程度を比較することによって繊維形成に必要なドメイン構造を特定する予定である。
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