胃腸管内在ニューロンのシグナル伝達における容量性Ca流入機構の分子機能解析

2003 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 15380200
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 研究機関: 北海道大学
• 研究代表者: 太田 利男 北海道大学, 大学院・獣医学研究科, 助教授 (20176895)
• 研究分担者: 稲波 修 北海道大学, 大学院・獣医学研究科, 助教授 (10193559)
• キーワード: カルシウムチャンネル / アデニンヌクレオチド / ブラジキニン / 細胞内カルシウム / TRP / パッチクランプ

研究概要

本年度は新生ラット小腸より単離培養した壁内神経細胞の細胞内Ca動態を解析する実験系の確立とアゴニストによるCa動員機構の解析、並びに容量性Ca流入チャネル蛋白質候補であるTRP遺伝子を神経モデル細胞に強制発現させ機能解析を行い、以下の成績を得た。
新生ラットからコラゲナーゼ処理により壁内神経を単離し、初代培養系を確立した。神経細胞は神経特異的抗体であるPGP9.5免疫陽性の有無により同定した。蛍光Ca指示薬を負荷した壁内神経細胞へ種々のアゴニストを適用し、本年度設置した画像解析装置により細胞内Caシグナルを可視化した。ブラジキニン及びATPは濃度依存性に細胞内Caを増加させた。Ca反応は一過性の初期相とその後の持続相よりなる二相性からなっていた。初期相の一部は細胞内貯蔵部位からのCa遊離により生じ、持続相は細胞外からのCa流入により生じることがわかった。ATPによるCa増加は容量性Ca流入阻害薬により有意に抑制された。膜電位固定した細胞ではATPによりCa透過性の非選択的陽イオン電流が発生し、薬理学的、免疫組織化学的解析によりこの電流は主にP2X2受容体を介して生じていることが分かった。クローニングした容量性Ca流入チャネルの候補分子(TRPC5)をラット褐色細胞腫へ遺伝子導入した。TRPC5発現細胞では、ブラジキニン及びUTPによるCa反応が有意に増大し、容量性Ca流入遮断薬はこの反応を強く抑制した。しかし、タプシガルジンにより活性化した容量性Ca流入の大きさは本遺伝子導入により変化しなかった。
本研究により胃腸管内在ニューロンのシグナル伝達に容量性Ca流入機構が機能していることが明らかになった。これまで、報告されていたTRPC5は受容体作動性Ca流入として機能するが、容量性Ca流入チャネルとは異なっていることが示された。現在、このシグナルの活性化機構を解明するとともに、他のTRP分子のクローニングと遺伝子発現実験から、このチャネルを担っている分子を同定するための実験を行っている。

研究成果

• [文献書誌] Yonekubo K., Ohta T., Nakazato Y., Ito S.: "Two distinct inhibitory actions of steroids on cholinoceptor-mediated secretion of catecholamine from guinea-pig adrenal medullary cells"Neurosci.Lett.. 337. 89-92 (2003)
• [文献書誌] Niwa K., Inanami O., Yamamori T., Ohta T., Hamasu T., Kuwabara M.: "Redox regulation of PI3K/Akt and p53 in bovine aortic endothelial cells exposed to hydrogen peroxide"Antioxid Redox Signal. 5. 713-722 (2003)
• [文献書誌] Ohta T., Morishita M., Mori Y., Ito S.: "Ca^<2+> store-independent augmentation of [Ca^<2+>]_i responses to G-protein coupled receptor activation in recombinantly TRPC5-epressed rat pheochromocytoma (PC12) cells"Neurosci.Lett.. 358. 161-164 (2004)
• [文献書誌] Morishita M., Ohta T., Mori Y., Ito S.: "Augmentation of [Ca^<2+>]_i responses to G-protein coupling agonists in TRP5-expressed neurosecretory PC12 cells"J.Pharmacol.Sci.. 91. 95 (2003)