オボアルブミンへの生物機能の付与に関するタンパク質工学的研究

2004 年度 研究成果報告書概要

• 研究課題/領域番号: 15380229
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 応用分子細胞生物学
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 広瀬 正明 京都大学, 農学研究科, 教授 (60026523)
• 研究分担者: 高橋 延行 京都大学, 農学研究科, 助手 (20252520) ; 水谷 公彦 京都大学, 農学研究科, 助手 (40314281)
• 研究期間 (年度): 2003 – 2004
• キーワード: オボアルブミン / セルピン / ループ挿入 / コンフォメーション変化 / プロテアーゼ阻害

研究概要

オボアルブミンは、セリンプロテアーゼ阻害能をもつセルピンと祖先を共通にするが、阻害機能をもたない。そこでロジカルな設計に基づく変異を加え、本タンパク質に阻害活性を付与するための研究を行った。申請者らは、オボアルブミン変異体R339Tでは、この部位がヒンジとして働きelastaseによる活性サイトの切断後、阻害活性に不可欠のステップであるループ挿入を起こすことを結晶構造解析により証明した。この発見は、オボアルブミンに阻害機能を付与するための一つの到達点となったが、活性セルピンでみられるような酵素との1:1の化学量論的な阻害活性は未だ認められない。そこで、さらなる変異をロジカルに設計するために、proteinaseにより切断を受ける活性サイトをtrypsin感受性にしたオボアルブミン変異体(A352R/R339T)を調製し、ループ挿入の速度をHPLCを用いて高精度に分析する手法を確立した。ループ挿入速度の高速化が、proteinaseの阻害活性の獲得に直接つながるため、ループ挿入速度を速めるための更なる変異実験を行った。オボアルブミン変異体R339Tの結晶構造を、阻害活性をもつセルピンの構造と比較すると、ループ挿入に必要なストランド3Aと5Aの間の開放に必要な、β-シートAの柔軟性に対し、抑制要因となる構造が見つかる。そこで、これらの抑制要因を除くためさらなる変異体として、K290T/R339T/A352RとR104A/R339T/A352R、及びS-S結合を切断したR339T/A352R(SH-R339T/A352R)を調製した。上記のHPLC法を使ってループ挿入速度を測定した結果、ループ挿入速度はA352R/R339Tに比べ、K290T/A352R/R339T、R104A/A352R/R339T、SH-A352R/R339Tで、それぞれ1.5、3.7、および6.7倍も上昇することが分った。これらの結果は、ループ挿入反応の遷移状態では、β-シートAが開いた構造をとるモデルに一致した。これにより、オボアルブミンにセリンプロテアーゼ阻害能を付与するための論理基盤が確立された。

研究成果

• [雑誌論文] Thermostability of refolded ovalbumin and S-ovalbumin. (2005)
  • 著者名/発表者名: N.Takahashi
  • 雑誌名: Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry (発表予定)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Dynamic mechanism for the serpin loop insertion as revealed by quantitative kinetics. (2005)
  • 著者名/発表者名: N.Takahashi
  • 雑誌名: Journal of Molecular Biology (発表予定)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Thermostability of refolded ovalbumin and S-ovalbumin. (2005)
  • 著者名/発表者名: N.Takahashi
  • 雑誌名: Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry (in press)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Dynamic mechanism for the serpin loop insertion as revealed by quantitative kinetics. (2005)
  • 著者名/発表者名: N.Takahashi
  • 雑誌名: Journal of Molecular Biology (in press)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Refolding mechanism of ovalbumin : Investigation by using a starting urea-denatured disulfide isomer with mispaired Cys367-Cys382. (2003)
  • 著者名/発表者名: M.Onda
  • 雑誌名: The Journal of Biological Chemistry 278-26 ページ: 23600-23609
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Crystal structure of S-ovalbumin as a non-loop-inserted thermostabilized serpin form. (2003)
  • 著者名/発表者名: M.Yamasaki
  • 雑誌名: The Journal of Biological Chemistry 278・37 ページ: 35524-35530
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Refolding mechanism of ovalbumin : Investigation by using a starting urea-denatured disulfide isomer with mispaired Cys367-Cys382. (2003)
  • 著者名/発表者名: M.Onda
  • 雑誌名: The Journal of Biological Chemistry 278(26) ページ: 23600-23609
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Crystal structure of S-ovalbumin as a non-loop-inserted thermostabilized serpin form. (2003)
  • 著者名/発表者名: M.Yamasaki
  • 雑誌名: The Journal of Biological Chemistry 278(37) ページ: 35524-35530
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [図書] Egg white proteins-ovalbumin. in Progress in Biotechnology 23 (Industrial Proteins in Perspective)(ed. Aalbersberg et al.) (2003)
  • 著者名/発表者名: M.Hirose
  • 総ページ数: 4
  • 出版者: Elsevier
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [図書] Progress in Biotechnology 23(Indus-trial Proteins in Perspective, ed. Aalversberg et al.)
  • 著者名/発表者名: M.Hirose
  • 総ページ数: 23
  • 出版者: Egg white proteins-ovalbumin.
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より