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今年度は、外来DNAの核内における挙動(核内動態)を詳細に検討した。
まず、DNA量の解析が容易なnaked DNAの投与を行った。マウスの尾静脈より、2mLの生理食塩水に溶解させたnaked DNA(500ng)を急速に投与した(hydrodynamics-based injection)。経時的に、肝臓におけるルシフェラーゼ活性・DNA量・メチル化頻度を測定したところ、
(1)DNA1コピー当たりのルシフェラーゼ活性は急速に減少する(silencing)
(2)核内で断片化が生ずる
(3)メチル化は主として断片化DNAに生ずる
(4)intactなプラスミドのメチル化頻度は低いまま保たれている
(5)silencingはメチル化と無関係に生ずる
ことが明らかとなった。
また、カチオニック脂質を用いて培養細胞にDNAを導入し、AUCを用いてDNA1コピー当たりのルシフェラーゼ発現量を計算した。その結果、DNA1コピー当たり、4×10^5以上(NIH3T3細胞)、2×10^4以上(HeLa細胞)分子のルシフェラーゼ蛋白質が産生されていると推定された。
核内動態制御の1つとして遺伝子修復法の研究を進めた。その結果、一本鎖ファージミドDNA由来の一本鎖直鎖状DNAを用いる方法が、従来のPCR産物を用いる方法に比較して、10倍以上の効率で遺伝子修復を行えることが明らかとなった。
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