| 研究概要 |
当初の研究計画のうち、平成15年度分のほとんど全てを予定通り遂行できた。詳細は以下の通りである。
1.cDNAライブラリーの作製とスクリーニング用上皮細胞株の確立
まず培養上皮細胞であるEph4,MDCK細胞から単離したpoly (A)+ RNAを用いて、C末端側にGFPを結合させた形の融合蛋白質を発現できるcDNAライブラリーを、レトロウイルスベクターの系で作製した。さらに、マウスレトロウイルス受容体を安定に強制発現させたMDCK細胞を樹立し、実際にレトロウイルスベクターを高い感染効率で導入できることを確認した。
2.スクリーニング
条件検討のためにEph4細胞由来cDNAライブラリーを用いて小スケールでスクリーニングを試行した。この過程で検鏡、細胞培養法等、今回のスクリーニングの中で工夫の必要なステップについて現実的な手順を確立した。その結果を取り入れて、MDCK細胞由来cDNAライブラリーを用いた中規模のスクリーニングを3回行った。手順は、1)スクリーニング用MDCK細胞へのcDNAライブラリーの導入、2)セルソーターによるGFP融合蛋白質発現細胞の選別と培養、3)蛍光顕微鏡観察による局在スクリーニング、4)細胞のクローニングとストック、5)ゲノムDNAの回収とPCRによるcDNAの同定、6)全長cDNAのクローニングと強制発現による細胞内局在の確認、とした。この過程で、既知の蛋白質に加えて、細胞間接着構造、アピカル側細胞膜、中心体といった細胞内構造に局在する未知の(塩基配列の報告はあっても局在として未知)蛋白質がこの方法で実際に同定できることが明らかになった。現在、このスクリーニングで得られた分子の機能解析を開始するとともに、さらに大規模なスクリーニングを予定している。
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