心筋の酸化ストレス応答を媒介する蛋白ORAIPの受容体の同定と障害抑制法の開発

2003 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 15390240
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 世古 義規 東京大学, 医学部附属病院, 講師 (30240708)
• 研究分担者: 新藤 隆行 東京大学, 医学部附属病院, 助手 (90345215) ; 久保田 俊一郎 東京大学, 大学院・総合文化研究科, 教授 (00260480)
• キーワード: 酸化ストレス / 心筋細胞 / オートクライン / アポトーシス / MAPK / 生理活性因子 / 受容体

研究概要

我々はこれまでの研究により、心筋細胞の酸化ストレス応答を媒介しアポトーシスを誘導する生理活性因子を同定し、oxidative stress-responsive apoptosis inducing protein (ORAIP)と命名した。そこで今年度は、(1)ORAIPを精製し、その生理活性を解析すること、(2)心筋細胞上に発現すると考えられるORAIP受容体を単離・同定すること、を目的とした。
(1)はじめにORAIPに対する特異抗体を作成し、アフィニティー・クロマトグラフィーを用いてnatural ORAIPを単離・精製することを試みたが、ORAIPのアミノ酸配列が種を超えて保存されているためアフィニティー活性の強い抗体ができにくく、この方法では精製は困難と判断した。
(2)次にヒトのORAIP遺伝子を単離して、CMV promotorの下流にヒトのORAIP遺伝子、さらにMycおよびHis-tagの遺伝子をtandemにつないだ発現vectorを作成し、適当なcell lineに遺伝子導入して発現させた。この細胞に酸化ストレス刺激を負荷することにより培養上清中に放出されたヒトのORAIPをNiカラムを用いて精製した。このrecombinant human (rh) ORAIPを培養心筋細胞に負荷することにより、短時間でのMAPKの活性化、および長時間での心筋細胞のアポトーシス誘導を観察したところ、それぞれの活性を確認した。
(3)そこで、rh ORAIPをNiをコートしたチップ上に接着させ、心筋細胞の膜を可溶化した溶液とincubateすることにより心筋細胞上に発現すると考えられるORAIP受容体を特異的に接着させる。このチップを質量分析計で解析することにより、ORAIP受容体の配列を同定する、という方法で研究を進めている。

研究成果

• [文献書誌] Fukino K, Sata M, Seko Y, et al.: "Genetic background influences therapeutic effectiveness of VEGF."Biochem Biophys Res Commun. 310. 143-147 (2003)
• [文献書誌] Seko Y, Sugishita K, Sato O, et al.: "Expression of costimulatory molecules (4-1BBL and Fas) and MHC class I chain-related A (MICA) in aortic tissue with Takayasu's arteritis."J Vas Res. 41. 84-90 (2004)
• [文献書誌] Seko Y, Fukuda S, Nagai R: "Serum levels of endostatin, vascular endothelial growth factor (VEGF), and hepatocyte growth factor (HGF) in patients with acute myocardial infarction undergoing early reperfusion therapy."Clin Sci. (in press).
• [文献書誌] Seko Y, Fujimura T, Taka H, et al.: "Hypoxia followed by reoxygenation induces secretion of cyclophilin A (CyPA) from cultured rat cardiac myocytes."Biochem Biophys Res Commun. (in press).