脳血管関門を通過する酵素製剤の開発に関する研究

2003 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 15390328
• 研究機関: 東京慈恵会医科大学
• 研究代表者: 大橋 十也 東京慈恵会医科大学, 医学部, 助教授 (60160595)
• 研究分担者: 小林 正久 東京慈恵会医科大学, 医学部, 助手 (20312019) ; 津田 隆 東京慈恵会医科大学, 医学部, 講師 (50188554) ; 井田 博幸 東京慈恵会医科大学, 医学部, 助教授 (90167255)
• キーワード: ムコ多糖症 / HIV-Tat / 遺伝子治療 / 脳血管関門 / ファブリー病

研究概要

ムコ多糖症VII型の欠損酵素であるbeta-glucuronidase(HBG)のcDNAとHIVのTat遺伝子をDNAレベルで融合させた。HBGの3'末端にTat遺伝子をin frameで融合させた。今回用いたTatの配列はYGRKKRRQRRRRであり、これは報告されているものより一つRが多くなっている。これをレトロウイルスベクターであるpMNDXSNに挿入しパッケージング細胞にカルシュウムリン酸法で導入した。高力価のクローンを酵素活性にてスクリーニングしたところmockが535 nmol/h/mgであったのに対し5190nmol/h/mgまで上昇したものがあった。このクローンの上清を、NIH 3T3細胞に加え2日後活性を測定した。活性は401nmol/h/mgより4267nmol/h/mgに上昇した。これにより少なくともtatを融合させても酵素活性に大きな影響がないことが判明した。NIH 3T3でウイルス力価を測定したところ7x10^2/mlであった。現在、より高力価のウイルスを得るべく他のパッケージング細胞を用いて実験中である。またファブリー病の欠損酵素であるalpha-galactosidaseAにも、より良く各臓器に分布する酵素製剤開発のためにTatを融合させた。PCAwtに融合遺伝子を挿入後、293細胞にカルシウムリン酸法で導入し3日後に活性を測定した。活性はべースライン989nmol/h/mgより19421nmol/h/mgまで上昇した。Tatを融合させない場合は14457nmol/h/mgであった。上清ではそれぞれベースラインの27nmol/mlより10155nmol/ml、1133nmol/mlまで上昇した。よってalpha-galactosidase AにおいてもTat融合は酸素活性を大きくかえないことが判明した。今後酵素を濃縮し、精製後、マウスに注入予定である。

研究成果

• [文献書誌] 大橋 十也: "ロイコジストロフィー"小児内科. 増刊35. 451-454 (2003)
• [文献書誌] 衛藤 義勝, 大橋 十也, 他: "日本人ファブリー病患者における酵素補充療法:第II相オープン試験の結果"小児科診療. 66・8. 1435-1444 (2003)
• [文献書誌] 衛藤 義勝, 大橋 十也, 他: "ファブリー病患者に対するα-ガラクトシダーゼA補充療法の他施設臨床試験成績"小児科臨床. 56. 133-143 (2003)
• [文献書誌] Kimura T, Ohashi T, Kikuchi T, Kiyota H, Eto Y, Ohishi Y: "Antitumor immunity against bladder cancer induced by ex vivo expression of CD40 ligand gene using retrovirus vector"Cancer Gene Ther. 10(11). 833-839 (2003)
• [文献書誌] Meng XL, Shen JS, Ohashi T, Maeda H, Kim SU, Eto Y: "Braintrasplantation of genetically engineered human neural stem cells globally corrects brain lesions in the mucopolysaccharidosis type VII mouse"J Neurosci Res. 74(2). 266-277 (2003)
• [文献書誌] Hakuba N, Watabe K, Hyodo J, Ohashi T, Eto Y et al.: "Adenovirus-mediated overexpression of a gene prevent shearing loss and progressive inner hair cell loss after transient cochlear ischemia in gerbils."Gene Ther. 10(5). 426-433 (2003)