| 研究課題/領域番号 |
15390329
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| 研究機関 | 福岡大学 |
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研究代表者 |
廣瀬 伸一 福岡大学, 医学部, 助教授 (60248515)
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| 研究分担者 |
満留 昭久 福岡大学, 医学部, 教授 (30038749)
上原 明 福岡大学, 医学部, 助教授 (60140745)
上野 伸哉 弘前大学, 医学部, 教授 (00312158)
兼子 直 弘前大学, 医学部, 教授 (40106852)
岡田 元宏 弘前大学, 医学部, 講師 (10281916)
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| キーワード | チャネル / 受容体 / てんかん / 中枢神経 / 遺伝子 |
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| 研究概要 |
申請者らが収集・管理している遺伝子バンクを利用して
1.既知の中枢神経発現イオンチャネル・チャネル内臓型受容体の遺伝子に関して、網羅的に変異を高速スクリーニングを行う。
2.数種のK+チャネルの変異が発見されたので該当cDNAに組込み、培養細胞に発現させ、異常を生理学的に検証する。
3.ゲノム情報より、未知の候補イオンチャネル・チャネル内臓型受容体の遺伝子を検索し、中枢神経発現を確認し、1〜2のスクリーニングシステムに乗せる。
目的で以下の研究をおこなった
(1)変異のスクリーニング
1)PCRプライマー設計・作成
内向き整流K^+チャネル数種の行程に適した約300bp長ずつを増幅できるプライマーを設計作成した。
2)対象症例の選択
現在収集している遺伝子バンク中の異なった病型のうち、典型例数例を対象として選択した。遺伝子異常が判明した既知の病型と類似またはチャネル・受容体との関連が特に疑われる病型(欠神や熱性けいれん頻回例)を優先した。
3)変異スクリーニング
高速化を図るため、PCR増幅、産物の精製、泳動検定等、すべて工程は96穴プレート単位で行った。(約200例)PCR産物の塩基配列中に変異がないか次の方法で検索した。高速シークエンスPCR産物をそのまま直接シークエンス法にて解析を行った。(福岡大学現有のABI3100、310、377と共同実験施設の理化学研究所のメガシークエンサーABI3700を利用)。ダイターミネーター反応、精製、乾燥まですべて96穴プレート単位で行った。
(2)変異のチャネル・受容体の生理学的検証
てんかん患者で発見された、変異をHEK細胞に発現させ、その電気的特性について現在パッチクランプにて解析を実施中である。
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