siRNAトランスジェニックマウスを用いた表皮EGFファミリーの特異的機能の研究

2003 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 15390343
• 研究機関: 愛媛大学
• 研究代表者: 佐山 浩二 愛媛大学, 医学部, 助教授 (80187286)
• 研究分担者: 山崎 研志 愛媛大学, 医学部, 助手 (40294798) ; 白方 裕司 愛媛大学, 医学部, 助手 (50226320) ; 橋本 公二 愛媛大学, 医学部, 教授 (00110784)
• キーワード: siRNA / HB-EGF / TGF-α / amphiregulin / epiregulin / knockout mouse / keratinocyte / cre recombinase

研究概要

本研究の目的は、siRNA (small interfering RNA)トランスジェニックマウスを用いて、表皮においてもっとも重要な働きを持つ4種のEGF family細胞成長因子(TGF-α,HB-EGF,amphiregulin,epiregulin)の機能欠損マウスを作成し、表皮における各々の因子の特異的機能を明らかにすることである。
平成15年度は以下の検討を行った。
HB-EGF,TGF-α,amphiregulin,epiregulin対応siRNAの作成
以下の手順で、HB-EGF,TGF-α,AR,ER対応siRNAを作成した。
(1)siRNA候補配列(19塩基配列)をsiRNA選択用ソフトウエアを用いて数種類決定。
(2)siRNA construction kitを用いて、in vitro転写でsiRNAを合成しカラムにて精製した。
(3)表皮細胞に候補siRNAをtransfectionし、mRNA発現を検討し、至適siRNA配列を決定した。この時、EGF刺激によるTGF-α,AR,ERのmRNAオートクライン誘導の制御の検討がもっとも適しているため、EGF刺激における各mRNAの発現をreal time PCR法、RNase protection assay法にて検討し、それぞれのsiRNAが特異的に対応するmRNA誘導を抑制しているかについて確認した。
表皮特異的HB-EGFノックアウトマウスの作成
HB-EGF遺伝子をloxPではさんだDNAを発現するHB-EGF flox/floxマウスとK5 promoter/Creマウスと交配することにより各ヘテロノックアウトマウスを作成し、さらにヘテロ同士を交配させることにより表皮特異的ノックアウトマウスを作成した。表皮特異的にHB-EGFがノックアウトされていることを表皮角化細胞、心臓、腎臓、肺、肝臓からtotal RNAを抽出し、HB-EGF特異的primerをもちいてRT-PCR解析することにより確認した。

研究成果

• [文献書誌] Yahata Y, Shirakata Y, Tokumaru S, Yamasaki K, Sayama K, et al.: "Nuclear translocation of phosphorylated STAT3 is essential for VEGF-induced human dermal microvascular endothelial cell migration and tube formation"The Journal of Biological Chemistry. 278. 40026-40031 (2003)
• [文献書誌] Shirakata Y, Tamai K, Nakaoka H, Tokumaru S, Sayama K, et al.: "Severe Palmo-plantar Hyperkeratosis in Koebner Epidermolysis Bullosa Simplex"The Journal of Dermatology. 30. 135-140 (2003)
• [文献書誌] Tsuda T, Thoyama M, Yamasaki K, Shirakata Y, Yahata Y, Sayama K et al.: "Lack of evidence for TARC/CCL17 production by normal human keratinocytes in vitro"The Journal of Dermatological Science. 31. 37-42 (2003)
• [文献書誌] Yamasaki K, Hanakawa Y, Tokumaru S, Shirakata Y, Sayama K, et al.: "SOCS1/JAB and SOCS3/CIS3 negatively regulate the STATs signaling pathway in normal human epidermal keratinocytes"The Journal of Investigative Dermatology. 120. 571-580 (2003)
• [文献書誌] Yamasaki K, Toriu N, Hanakawa Y, Shirakata Y, Sayama K, et al.: "Keratinocyte growth inhibition by high-dose epidermal growth factor is mediated by transforming growth factor β autoinduction : A negative feedback mechanism for keratinocyte growth"The Journal of Investigative Dermatology. 120. 1030-1037 (2003)
• [文献書誌] Shirakata Y, Tokumaru S, Yamasaki K, Sayama K, Hashimoto K: "So-called biological dressing effects of cultured epidermal sheets are mediated by the production of EGF family, TGF-β and VEGF"The Journal of Dermatological Science. 32. 209-215 (2003)
• [文献書誌] 佐山浩二: "皮膚疾患最新の治療"本郷 允彦. 2 (2003)