| 研究課題/領域番号 |
15390459
|
|---|
| 研究機関 | 岡山大学 |
|---|
研究代表者 |
廣畑 聡 岡山大学, 大学院・医歯学総合研究科, 助手 (90332791)
|
|---|
| 研究分担者 |
米澤 朋子 岡山大学, 大学院・医歯学総合研究科, 助手 (30304299)
大橋 俊孝 岡山大学, 大学院・医歯学総合研究科, 講師 (50194262)
二宮 善文 岡山大学, 大学院・医歯学総合研究科, 教授 (70126241)
西田 圭一郎 岡山大学, 大学院・医歯学総合研究科, 助手 (80284058)
|
|---|
| キーワード | アグリカナーゼ / リウマチ性関節炎 / マトリックスメタロプロテアーゼ |
|---|
| 研究概要 |
1 リアルタイムPCR法による各アグリカナーゼ遺伝子の発現
IL-1β刺激後の培養細胞より抽出したmRNAよりリアルタイムRT-PCRを行い、各アグリカナーゼの発現を定量的に比較検討を行った。またIL-1βのアグリカナーゼ誘導能に及ぼす時間的影響および容量的影響についても検討を行った。
2 各アグリカナーゼに対する特異的抗体を作成
ADAMTS-9に対するポリクローナル抗体を樹立し、その解析を行った。上記のADAMTS9発現誘導系におけるタンパクレベルでの確認を目的としてウエスタンブロットを行うためにまず条件設定から行った。
タンパク抽出のための条件設定を行い、次にウエスタンブロット法にて、予想通りのサイズのバンドが得られるか確認を行った。患者滑膜組織の収集を行った。組織をホルマリン固定し、パラフィン抱埋処理を実施した。これらのパラフィン切片にて我々のポリクローナル抗体が有効であるか検討を行った。至適染色条件の設定を行った。
3 アグリカナーゼ3発現コンストラクトの作製
発現コンストラクトの作製は困難であった。原因として制限酵素の特異性などが考えられた。代替の方法にて検討した。すなわち、活性型のものを想定して、proドメイン以下のものを発現するようなコンストラクトの作製を行った。これらのコンストラクトは、今後モノクローナル抗体の作製などにあたって重要となると思われた。
4 ノックアウトマウスの作製
コンストラクトの作製は完了した。海外共同研究にてES細胞への組み込みの段階である。
|
