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昨年度作成したtargeting vectorをmouse strain 129SvEv由来のES細胞にelectropolationした後、G418(Neo)による薬剤耐性選択を行い出現したコロニーを採取した。
採取したES細胞のDNAをPCRで相同組み換え体をscreeningし、さらにサザン解析にてsingle integrationの確認を行った。PCR screeningは、Neo遺伝子に設定した2つのforward primerとtargeting vectorの外側の3つのreverse primerを用いて、Taq polymeraseとしてKOD Dash (Toyobo)で実施したところ、全てで陽性が得られたcloneが10得られたので、この全てに対してサザン解析を行った。サザン解析は、targeting vectorの3'下流にあるEcorI/EcorV siteで切り出される断片をtemplateとしてFITC label nonRI probeを作成した。ES細胞のゲノムは、ScaI (targeting vector3'下流でtargeting vectorの領域内と領域外とにある)で処理したものを電気泳動した。Membraneに移した後、hybridizationを行った。その結果、3つの陽性クローンが得られた。
再培養を開始した陽性細胞の中から2つのクローンをC57BL/6 mouseのblastcystへmicroinjectionを実施した。その結果片方のクローンから6匹のマウスが生まれ、3匹がキメラ率100%のメスであった。もう一方のクローンからは生まれなかった。
オスのキメラマウスが得られなかったので現在再度microinjectionを行っているところである。
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