| 研究概要 |
1)キメラマウスの作成
昨年度得られたF1ヘテロマウスを用い交配を行い、以下の要領でgenotypingを行った。
2)genotyping
NEO遺伝子の確認は、3つのプライマーを用いてPCRにて行った。すなわち、Wild type gene上に存在するforward primer (1),backward primer (II),そしてNeo上に存在するforward primer (III)である。(1)(II)にて533bp(wild type),(II)(III)にて273bp (homo)のPCR fragmentが得られる(heteroでは2つのバンド)。また、EGFP遺伝子の確認は、EGFP上に存在する2つのプライマーを用いてPCRにて行った。
結果:オス28匹中、8匹がwild type、20匹がhetero typeであった。また、メス29匹中、8匹がwild type、21匹がhetero typeであった。しかしHomo typeは得られなかった。
3)免疫組織化学
hetero type3匹を使って脳におけるGFPの発現を蛍光顕微鏡にて確認したところ、2匹では蛍光は血管にのみ認められ神経細胞での発現はなかった。1匹では神経細胞、さらには青斑核での発現を認めたが、蛍光強度は弱かった。以上の結果から、このcell Iineのマウスでは、α2Aアドレナリン受容体-GFP癒合蛋白の発現が何らかの原因で傷害されており。このマウスでは機能解析は困難と考え、別のcelllineのマウスを再度作り直す事にした。
4)Electropolation-Microinjection
targeting vectorをmouse strain 129SvEv由来のES細胞に再度、electropolationし、screeningし、陽性クローンをmicroinjectionした。
5)F1ヘテロ
キメラマウスから、F1ヘテロマウスを得た。現在、F1ヘテロマウスの交配中である。
ヘテロマウスの作成をやり直すこととなり、年度内にはα2Aアドレナリン受容体一GFP癒合蛋白の機能解析はできなかった。従って現時点で発表できる業績はないが、F1ヘテロとはいえ、このような遺伝子改変マウスは我々しか作成しておらず、このマウスの存在だけでも大きな業績と考える。しかし今後もこの実験を続け、ホモマウスが得られたら、予定通り機能解析を行う予定である。また、他施設との共同研究も行う予定である。
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