| 研究概要 |
Phosphodiesterase(PDE)の免疫染色のためラットより大腿骨を摘出し,脱灰後,固定,包埋を行い,パラフィン切片を作成した.また,PDE抗体を確認するためウエスタブロットを行った.
PDEのin situ hybridizationのためラットより大腿骨を摘出し,脱灰後,固定,包埋を行い,パラフィン切片を作成した.パラフィン切片上のRNAを確認するためにポリAに対するプローブでin situ hybridizationを行いRNAの保存を確認した.PDEのプローブを作成し,発現を確認するためにリアルタイムPCRを行い発現を確認した.
海外共同研究のDr.Manganielloが米国国立衛生研究所でPDEのノックアウトマウスを作成し,組織を摘出後,固定包埋を行った.
Short interfering RNAs(siRNA)によるPDE発現阻害の検討のため,マウス頭蓋冠由来骨芽細胞様細胞MC3T3-E1細胞よりトータルRNAを抽出,RT-PCR後,PCR産物をクローンし,シークエンスを行い確認した.また,MC3T3-EI細胞でPDEの発現をリアルタイムPCRで検討し,石灰化期に発現が上昇することを認めた.更に,阻害実験での検討項目である骨形成因子(BMP-2,BMP-4など),osteonectinや内部コントロールであるglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenaseの発現もリアルタイムPCRで確認した.
上記研究結果の検討を行い,更に研究を進めている.
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