| 研究概要 |
ピレン資化性細菌H2-5株の産生するタンパク質を栄養培地(Tryptic soy broth, TSB)とピレンを唯一の炭素源とする培地(MMP)それぞれで生育した菌体から抽出し、それらの発現の違いからピレン分解に関係する酵素タンパク質を特定する目的で実験を行った。H2-5株をそれぞれの培地で30℃で培養し定常期で集菌した。菌体を1/15Mリン酸緩衝液(pH7.0)で洗浄後、超音波破砕し、18,000xg,15minの遠心分離を行って、cell debrisおよび未破壊菌体を除去した。上清(S1)を183,000xg,60minの超遠心分離を行い、可溶性画分(S2)と沈殿(膜画分,P2)に分離した。
(1)ホモジネート、S1、S2と上記緩衝液に懸濁したP2のタンパク質量を揃えてSDS電気泳動にかけ、ゲルをクーマシーブリリアントブルー(CBB)で染色し、脱色後、生育基質によるバンドパターンを比較した。その結果、MMP生育時に特異的なバンドが、S2とP2でそれぞれ4本ずつ、また、P2で発現量の増大するバンドが1本見い出された。(2)次に各画分をIPGphor電気泳動装置(アマシャムバイオサイエンス社製)で等電点電気泳動し、続いてSDS電気泳動を行う2次元電気泳動にかけた。ゲルをCBB染色し、脱色後、イメージマスター(ファルマシア社製)で泳動パターンを読み込み画像解析を行った。この方法では(1)と同様な分子量のバンドがさらに等電点の差から数スポットに分離されたが、P2では、約50kDaに3個の、約40kDaに4個程、また、約20kDaに1個のMMP生育に特異的なスポットが見られた。S2画分にもピレン資化時に特異的に発現するスポットが確認された。スポットがまだ不鮮明なので、今後、鮮明な泳動像を得る工夫をするとともに、アミノ酸配列分析とホモロジー検索を行ってこれらのタンパク質を特定する予定である。
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