| 研究概要 |
ピレン資化性細菌H2-5株のピレン分解に関係する酵素タンパク質を特定する目的で実験を行った昨年度の研究結果で、栄養培地(Tryptic soy broth, TSB)とピレンを唯一の炭素源とする培地のそれぞれで生育した菌体において、産生するタンパク質に二次元電気泳動でのスポットの違いを認めた。しかしながら、スポットが不鮮明であったため、これを改良する目的で、新たに、ピレン資化性細菌として、H2-5株に近縁なMycobacterium gilvumに属すると考えられるNo.3株とNo.4株を加えて、二次元電気泳動に供する試料の調製法、塩濃度、さらに、添加タンパク質量の検討を行った。
先ず、ピレン生育菌体に比べてTSB生育菌体ではタンパク質のスポットが極端に多く、発現タンパク質のスポットの差が見極めにくかったため、TSB培地の代わりに酢酸塩培地を用いてスポットの差を比べた。この結果、比較するスポット数が減少したが、酢酸塩生育菌体では得られるタンパク質量が少ないという欠点が生じた。そのため、試料の分画法のうち、菌体を超音波破砕したあと、18,000xg,15minの遠心分離した上清(S1)を、以前はさらに超遠心分離して可溶性画分と沈殿(膜画分)に分離していたが、これを止め、S1画分を用いて二次元電気泳動を行うことによりタンパク質の低濃度化を防いだ。次に、試料調製の際の塩濃度を低下させるため、S1画分のタンパク質をトリクロル酢酸(TCA)で沈澱させ、上清を除去後、沈殿を直接Lysis Bufferで溶解した。さらに、二次元電気泳動へ添加するタンパク質量を検討した結果、100μg添加時が最も鮮明なスポットを与えることが判明した。これらの改良を加えた分析の結果、ピレン生育時に特異的に増大または発現するタンパク質を、No.3株では9個、また、No.4株では7個確認した。
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