| 研究課題/領域番号 |
15510099
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| 研究機関 | 静岡大学 |
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研究代表者 |
山崎 昌一 静岡大学, 理学部, 助教授 (70200665)
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| 研究分担者 |
大橋 一世 千葉大学, 理学部, 教授 (90114248)
伊藤 忠直 京都大学, 大学院・理学研究科, 助教授 (90093187)
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| キーワード | アクチン / フィラミンA-ゲル / 一分子の蛋白質の力学特性 / フイラミン / ゲルの粘弾性 / 巨大リポソーム / 蛋白質のアンフォールディング / 原子間力顕微鏡 / 蛍光顕微鏡 |
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| 研究概要 |
HumanのフィラミンA(hsFLNa)をバキュロウイルスベクターを用いた昆虫培養細胞(sf9)での発現系を用いて生産するシステムを構築し、そこからhsFLNaをゲルろ過カラムなどにより精製することに成功し、以下の実験に用いた。
アクチン/フィラミンA-ゲル内のF-アクチンの熱運動の解析を行うために、少量の蛍光ラベル(テキサスレッドファロイジン)したF-アクチンと大量のラベルしていないF-アクチンからなるアクチン/フィラミンA-ゲルを作成し、その中でのF-アクチンの熱運動をEB-CCDカメラを用いた蛍光顕微鏡システムにより観察・解析した。その結果、アクチン/フィラミンA-ゲル内のF-アクチンは、波うち運動やレプテーションなどの熱運動が抑制されていることがわかった。
アクチン/フィラミンA-ゲルにずり応力がかかったときにフィラミンAがアンフォールディングを起こすかどうかを調べるために、蛍光顕微鏡を用いて研究するための準備をおこなった。まず、hsFLNaを蛍光プローブ(オレゴングリーン488マレイミド)で過剰にラベルした後、ゲルろ過で精製した。hsFLNaが天然状態の時は蛍光強度は小さかったが、塩酸グアニジンの濃度が増大するにつれて蛍光強度は増大し、5M塩酸グアニジン存在下では天然状態の時の3.5倍になった。これは塩酸グアニジンによりhsFLNaがアンフォールディングを起こすと、蛍光の自己消光が抑制されて蛍光強度が増大するためだと考えられる。また、高イオン強度下でリン脂質の巨大リポソーム内にアクチン/フィラミンA-ゲルを構築することに成功した。アクチン濃度が低い(2μM)ときは、巨大リポソーム内のアクチン/フィラミンAゲルをテキサスレッドファロイジンを用いて蛍光顕微鏡で観察することに成功した。
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