|
我々は以前、酵母を用いた真核生物遺伝子の機能推定方法を開発し、粘液型軟骨肉腫に特異的な融合遺伝子産物が従来指摘されてきた活性とは異なる新たな機能を獲得することを明らかにした。本方法の有用性および発展性を検討するため、active H-rasおよび機能未解明のがん抑制遺伝子であるmeninについて本方法を適用し、機能の解析を試みた。
遺伝子発現が制御可能なactive H-rasまたはmenin発現プラスミドを構築し、酵母へ導入した。次いで、変異誘発剤を用いて、プラスミドを導入した酵母のゲノム上にDNA変異を誘発させ、ヒト遺伝子要求性を示す変異株の同定を行った。さらに四胞子分析を用いて、1遺伝子変異によりヒト遺伝子要求性を示す酵母ミュータントの分離を試みた。結果、active H-rasを増殖に要求する酵母ミュータントを1株分離した。しかしmenin要求性を示す酵母ミュータントは見出されなかった。次にヒトがん遺伝子要求性を示した酵母ミュータント内に生じた遺伝子変異の同定を試みたが、本ミュータントは復帰変異株の発現率が高く、変異遺伝子の同定以前に要求性を消失するクローンが多数を占めた。最終的に変異部位をゲノム10Kb以内まで絞り込んだが、変異部位特定以前に表現型が消失し、変異株の安定性に問題があることが判明した。そこで、酵母内において安定にヒト遺伝子を発現させ解析するtwo-hybrid法を利用した解析法を用い、ガン細胞におけるpre-mRNAsplicing異常に関わる因子の探索を試みた。これはpre-mRNAsplicingの5'選択性に関与するU1 snRNPの構成タンパク質であるUICに注目し、U1Cに結合する因子のスクリーニングを酵母two-hybrid法を用いて行った。その結果、転写共役因子CARM1のisoformがU1Cに結合し、pre-mRNA splicingの5'選択性に影響を与えることを見出した。CARM1のisoformは少なくとも4種類が存在したが、うち1種類のみがsplicingへの干渉作用を示した。さらにCARM1 isoformは組織特異性を示し、isoform特異的な機能の存在が示唆された。加えてこの因子は、多くのがん細胞で発現しており、がん細胞におけるsplicing異常との関連が示唆された。
|
