2003 年度実績報告書

4'-thioNTPを用いる試験管内選抜法による機能性RNAの創製研究

研究課題

研究課題/領域番号	15510169
研究機関	北海道大学
研究代表者	南川典昭北海道大学, 大学院・薬学研究科, 助教授 (40209820)
キーワード	ヌクレオシド / ヌクレオチド / 4'-thioUTP / 4'-thioCTP / in vitro selection / RNA / アプタマー
研究概要	本研究では,in vitroでセレクションされた機能性RNAをin vivoで利用可能な分子とすることを目指し,新規なヌクレオシドトリリン酸体を合成し,in vitro selection法による機能性人工RNA創製のための基礎研究を行う.すでに4'-thioUTPおよび4'-thioCTPの合成を完了し,予備実験において両トリリン酸体がT7 RNAポリメラーゼの基質となることを明らかにしている.本年度はその結果をふまえさらに詳細にin vitro selection法への応用のための基礎的研究を行った.その結果,4'-thioUTPおよび4'-thioCTPは天然型UTPおよびCTPと比較して約90%の効率でRNA鎖に取り込まれる事が分かった.その効率は,従来in vitro selection法に用いられている2'-アミノ体(約50%)や2'-フルオロ体(約10%)と比較して極めて高い効率であった.さらに得られた修飾RNAは逆転写酵素によってcDNAへと変換でき,シークエンシングの結果,その配列に誤りがない事が確認できた.これにより4'-thioUTPおよび4'-thioCTPはin vitro selection法に適応可能であることが示された.またヌクレアーゼに対する抵抗性についてもRNase Aを用いて調べた結果,修飾RNAは天然型RNAと比較して50倍安定であることが明らかになった. 以上の結果を受け,現在ヒトトロンビンに対するin vitro selection法による修飾RNAアプタマーの獲得実験を行っている.30merのランダム配列を有するテンプレートDNAを用いた場合でも4'-thioUTPおよび4'-thioCTP存在下での転写反応は効率よく進行し,増幅・セレクション・逆転写のラウンドを計9回行った.各ラウンドのRNAプールのヒトトロンビンに対する結合活性を調べた結果,ラウンド9後ではプール全体の50%以上のRNAがヒトトロンビンに対して結合することが確認できた.今後,得られるRNAアプタマーのシークエンシング,2次構造予測を行うとともに,4'-thioATPおよび4'-thioGTPの合成ならびにin vitro selection法への適応を検討する.

研究成果

(6件)

すべてその他

すべて文献書誌 (6件)

[文献書誌] N.Minakawa et al.: "An Improved large scale synthesis of 1,4-anhydro-4-thio-D-ribitol"Tetrahedron. 59. 1699-1702 (2003)
[文献書誌] N.Minakawa et al.: "New Base Paring Motifs. The Synthesis and Thermal Stability of Oligodeoxynucleotides Containing Imidazopyridopyrimidine Nucleosides with the Ability to Form Four Hydrogen Bonds"J.Am.Chem.Soc.. 125. 9970-9982 (2003)
[文献書誌] N.Minakawa et al.: "A Versatile Modification of On-Column Oligodeoxynucleotides Using a Copper-Catalyzed Oxidative Acetylenic Coupling Reaction"J.Am.Chem.Soc.. 125. 11545-11525 (2003)
[文献書誌] A.B.Smith, III et al.: "Tremorgenic Indole Alkaloids. The Total Synthesis of (-)-Penitrem D"J.Am.Chem. Soc.. 125. 8228-8237 (2003)
[文献書誌] M.Tanimoto et al.: "No Enhancement of Nuclear Entry by Direct Conjugation of a Nuclear Localization signal Peptide to Linearized DNA"Bioconjugate Chem.. 14. 1197-1202 (2003)
[文献書誌] S.Hoshika et al.: "Investigation of physical and physiological properties of 4'-thioribonucleotide (4'-thioRNA)"Nucleic Acids Res.Suppl.. 3. 209-210 (2003)

2003 年度 実績報告書

4'-thioNTPを用いる試験管内選抜法による機能性RNAの創製研究

研究代表者

南川 典昭 北海道大学, 大学院・薬学研究科, 助教授 (40209820)

研究成果

[文献書誌] N.Minakawa et al.: "An Improved large scale synthesis of 1,4-anhydro-4-thio-D-ribitol"Tetrahedron. 59. 1699-1702 (2003)

[文献書誌] N.Minakawa et al.: "New Base Paring Motifs. The Synthesis and Thermal Stability of Oligodeoxynucleotides Containing Imidazopyridopyrimidine Nucleosides with the Ability to Form Four Hydrogen Bonds"J.Am.Chem.Soc.. 125. 9970-9982 (2003)

[文献書誌] N.Minakawa et al.: "A Versatile Modification of On-Column Oligodeoxynucleotides Using a Copper-Catalyzed Oxidative Acetylenic Coupling Reaction"J.Am.Chem.Soc.. 125. 11545-11525 (2003)

[文献書誌] A.B.Smith, III et al.: "Tremorgenic Indole Alkaloids. The Total Synthesis of (-)-Penitrem D"J.Am.Chem. Soc.. 125. 8228-8237 (2003)

[文献書誌] M.Tanimoto et al.: "No Enhancement of Nuclear Entry by Direct Conjugation of a Nuclear Localization signal Peptide to Linearized DNA"Bioconjugate Chem.. 14. 1197-1202 (2003)

[文献書誌] S.Hoshika et al.: "Investigation of physical and physiological properties of 4'-thioribonucleotide (4'-thioRNA)"Nucleic Acids Res.Suppl.. 3. 209-210 (2003)

2003 年度実績報告書

南川典昭北海道大学, 大学院・薬学研究科, 助教授 (40209820)