| 研究概要 |
植物は,多様な天然物を生産する.それらは多段階の酵素反応により生合成されるので,細胞内での効率的な生合成の仕組みが推定される.イソフラボノイドはマメ科植物に集中して分布し,ファイトアレキシンや窒素固定細菌との共生における化学シグナルとして環境中での生育に重要な役割を果たしている,本研究では,イソフラボノイド系の生合成酵素・遺伝子の全貌を明らかにし,効率的な生合成の機構を解析した.
酵素活性を指標にしてcDNAライブラリーから標的酵素cDNAを持つクローンを単離する「機能発現分画スクリーニング」や,コンセンサス配列に基づくRT-PCR,さらにEST情報を利用し,マメ科カンゾウ,ミヤコグサ,ダイズからイソフラボン合成系の2-ヒドロキシイソフラバノン4'O-メチル基転移酵素(HI4'OMT)や脱水酵素(HID),ファイトアレキシン骨格の構築に必須なプテロカルパン還元酵素(PTR)をコードするcDNAをはじめて同定した.これによりファイトアレキシン生合成系の酵素の全貌が明らかになり,主要な酵素cDNAのクローニングが達成された.
6'-デオキシカルコン生合成に関与するポリケチド還元酵素が,レトロカルコン生合成の後期段階の反応も触媒することを大腸菌発現系を用いて現らかにした.同一経路上の離れた段階の反応を一つのタンパク質が触媒し,酵素の再利用により生合成反応が行われている可能性が示唆された.OMTに特異的なアフィニティカラムを用いてカンゾウHI4'OMTの部分精製を行った.HIDがHI4'OMTと同一フラクションに溶出され,HI4'OMTとHIDの間でタンパク質間相互作用が示唆された.さらにイソフラボン骨格合成酵素(IFS)とHIDを酵母で共発現させ,異種細胞でのイソフラボン合成能を格段に向上させた.IFS, HID反応の共役により含量が増加した可能性が示唆された.
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