根培養系を用いた免疫化学的手法による代謝関連遺伝子の機能解析に関する研究

2003 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 15510189
• 研究機関: 独立行政法人理化学研究所
• 研究代表者: 村中 俊哉 独立行政法人理化学研究所, バイオケミカルリソース研究チーム, チームリーダー (60342862)
• 研究分担者: 田中 宏幸 九州大学, 大学院・薬学研究院, 助教授 (30253470)
• キーワード: アクティベーションタギング / 毛状根 / ステロイドサポニン / ステロイドサポゲニン / キンギンナスビ / ステロール / ステロイド / 植物組織培養

研究概要

毛状根を利用した遺伝子アクティベーションタギング(HR-AT)用ベクターを構築し、その評価を行った。すなわち、毛状根誘発に関与するrol遺伝子クラスター、プラスミドレスキューに用いるための大腸菌での複製開始点、マーカー遺伝子、植物で機能するエンハンサー領域などを有するバイナリーベクターを構築した。このベクターを用いてシロイヌナズナをモデルに、形質転換毛状根クローンを取得した。同一カルスから誘発された異なる毛状根におけるT-DNA挿入領域を、プラスミドレスキューにより解析した。その結果、T-DNAが挿入された近傍の遺伝子の転写産物が、形質転換根でのみ検出され、毛状根を利用した遺伝子アクティベーションタギングが可能であることがわかった。また、ステロイドサポニンの生産制御の基盤的な知見を得るために、シロイヌナズナをモデルに、ステロール生合成の鍵酵素HMG-CoAレダクターゼ遺伝子破壊株の解析を行った。その結果、複数のHMG-CoAレグクターゼ遺伝子のうち、HMG1が、ステロール量の増減に大きく関与することが明らかとなった。
キンギンナスビの根から、ステロイドサポニンであるアキュレアチサイドA,Bを抽出した。さらに得られたアキュレアチサイドを加水分解することによりヌアチゲニン-3-グルコシド、ヌアチゲニン-25-グルコシド、ヌアチゲニン、および、イソヌアチゲニンをそれぞれ調製し、TLCおよびHPLC条件を確立した。さらに、キンギンナスビを無菌播種し、得られた幼植物を茎節培養した。茎節培養サンプルを材料とすることにより、ルーチンに毛状根クローンを作出できるようになった。これらの毛状根クローンを用いてEastern blottingの条件検討を行った。

研究成果

• [文献書誌] Masashi Suzuki et al.: "Loss of function of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase 1(HMG1) in Arabidopsis leads to dwarfing, early senescence and male sterility, and reduced sterol levels"The Plant Journal. 37・5. 750-761 (2004)
• [文献書誌] Noriko Nagata et al.: "Advanced Research on Plant Lipids(Murata, N., Yamada, M., Nsihida, I., Okuyama, H., Sekiya, J.and Wada, H., eds.) Action of mevalonic acid-derived isoprenoids in Arabidopsis. pp."Kluwer Academic Publications, Dordrecht. 439(245-248) (2003)
• [文献書誌] Masashi Suzuki et al.: "Advanced Research on Plant Lipids(Murata, N., Yamada, M.. Nsihida, I., Okuyama, H., Sekiya, J.and Wada, H., eds.) The study of the mechanism of cell elongation using an inhibitor of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase."Kluwer Academic Publications, Dordrecht. 439(249-252) (2003)