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薬剤耐性プラスミドR6Kを用いて、複製開始反応における適応が、どのようにしてプラスミドDNA分子集団で形成され、どのようなメカニズムで機能するかを分子レベルで解明することを目的とする。
本年度は先ず、動く遺伝子'IS5'のトランスポジションによるR6K DNA複製開始装置のDnaA蛋白非依存的複製への活性化メカニズムの解明とDnaA蛋白の機能解明、のために次の研究を行った。
1.DnaA蛋白-非依存的複製開始機能に必須のIS5配列の確定。
(1)IS5の種々の欠失変異誘導体を構築し、それらの活性測定を行った結果、2つの領域、transposase promoter領域およびBENT-DNA配列がシスに働く最少必須配列であることがわかった。
(2)IS5のoriDNAに対する挿入位置効が有ることを、in vitroの種々の組換え体を作り明らかにした。
(3)IS5に特徴的なBENT-DNA配列の機能を、合成BENT-DNA配列オリゴヌクレオチドで交換できることを明らかにできた。
さらに、BENT-DNA配列に選択的に結合するHN-S蛋白質の役割を検討した。
(4)Transposase gene promoter領域に部位特異的変異を導入して解析した結果、複製活性が低下した。
2.IS5の挿入によるDnaA蛋白-非依存的複製開始の活性化機構の解明。
複製開始装置の'IS5の挿入によるTranscriptional activation'の可能性を調べるためにtransposase promoterの代わりにPlac promoterで置換したところ、DnaA蛋白-非依存的複製開始反応が起きることがわかった。さらなる解析を行っている。
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