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クリプトクロムの機能と細胞内分布の相関を明らかにすることを目的として、研究計画どおりに、以下のふたつの視点から研究を進めてきた。
(1)蛋白工学的手法によるクリプトクロムの改変が細胞内局在特性に及ぼす影響では、イネクリプトクロム(OsCRY1)に核内輸送シグナル(NLS)や核外輸送シグナル(NES)を付与してOsCRY1の細胞内局在を人為的に制御したとき、その生理学的機能にどのような影響がでるかについて調査を開始した。これまでNLSに関するデータはあるが、NESのデータは貧困である。OsCRY1に付与するNES候補について検討を行ったところ、GFPを用いた系ではトマトHsfA2NESが効率よく機能した。また、挿入部位(N端かC端か)を検討したところ、いずれの場合も有効であるがN端のほうが効率的であった。一方、NES-GFPの核外輪送は、NESタンパク質受容体エクスポーチンの特異的阻害剤レプトマイシンBで阻害された。これらの知見に基づき、NLSをOsCRY1付与したNES-GFP-OsCRY1をもつプラスミドを構築し、形質転換体の作出中である。なお、NES-GFP-OsCRY1についても同様に進行している。
(2)クリプトクロムの細胞内局在を決定するパートナー分子の探索では、Far Western法によりOsCRY1と分子間相互作用を示すタンパク質の探索を開始した。具体的には、イネ緑葉mRNAでλ11ベクターにcDNAライブラリーを構築した。また、タンパク質プローブとして用いるために、OsCRY1タンパク質の一部分をGST融合タンパク質発現ベクターで作製・精製した。現在、cDNAライブラリーをスクリーニング中である。
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