ボツリヌス毒素複合体のサブユニット間相互作用およびX線結晶解析に関する研究

2004 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 15570103
• 研究機関: 東京農業大学
• 研究代表者: 大山 徹 東京農業大学, 生物産業学部, 教授 (60318178)
• 研究分担者: 渡部 俊弘 東京農業大学, 生物産業学部, 教授 (80175695) ; 中川 智行 東京農業大学, 生物産業学部, 講師 (70318179)
• キーワード: ボツリヌス毒素 / サブユニット構造 / X線結晶解析 / タンパク質複合体 / タンパク質問相互作用

研究概要

ボツリヌス毒素は、1分子の神経毒素(約150kDa)に非毒非血球凝集素成分(NTNHA)と3種の血球凝集素成分(HA)の合計5種のタンパク質が非共有結合的に会合し、650kDaの巨大な分子量を有するサブユニット構造の複合体として培養液中に産生される。このサブユニット構造は、毒素が消化管での酸性条件や種々の蛋白分解酵素に曝されるという過酷な条件下でも強い耐性を持つ特異的な構造を有していることが示されてきた。
本研究において、D型菌4947株(D-4947)を用い、複合体における個々のサブユニットタンパクの構成比を初めて明らかにした。すなわち、D-4947は、毒素複合体(650kDa L-TC、610kDa TCおよび540kDa TC)を大量に産生する。いずれも同じSDS-PAGEパターンを示すが、複合体におけるHA-33/17の分子数が異なっていた。HA-33/17分子の各TC種への滴定実験により、D型ボツリヌス650kDa L-TCは、神経毒素およびNTNHAが各1分子、HA-70が2分子、HA-33およびHA-17が各4分子からなるヘテロ12量体サブユニット構造であると結論した。
一方、従来法では困難であった複合体から神経毒素と無毒成分の大量分離・精製法をあらたに確立した。動的光散乱測定により純度を検定した毒素複合体(CおよびD型の4種)の結晶化を130通り実験条件により試みたが、解析に供する大きな結晶は得られていない。一方、サブユニットの種々の組合せの再構成によって調製された複合体および単一成分に対するトリプシン感受性の実験から、各サブユニット間相互作用を調べ、それらの立体的配置を推定した。これらにより、ボツリヌス毒素複合体のX線結晶解析による高次構造解析のための情報を得た。

研究成果

• [雑誌論文] Characterization of the interaction between subunits of the botulinum toxin complex produced by serotype D through tryptic susceptibility of the isolated components and complex forms. (2005)
  • 著者名/発表者名: Suzuki T, Watanabe T, Mutoh S, Hasegawa K, Kouguchi H, Fujinaga F, Oguma K, Ohyama, T.
  • 雑誌名: Microbiology -UK 151
• [雑誌論文] Characterization of Toxin Complex Produced by a Unique Strain of Clostridium botulinum type D 4947. (2004)
  • 著者名/発表者名: Hasegawa K, Watanabe T, Sato H, Sagane Y, Mutoh S, Suzuki T, Yamano Y, Kouguchi H, Takeshi K, Kamaguchi A, Fujinaga Y, Oguma K, Ohyama T.
  • 雑誌名: Protein J. 23 ページ: 371-378
• [雑誌論文] Complete Subunit Structure of Clostridium botulinum Type D Toxin Complex via Intermediate Assembly with Nontoxic Components. (2003)
  • 著者名/発表者名: Mutoh S, Kouguchi H, Sagane Y, Suzuki T, Hasegawa K, Watanabe T, Ohyama T.
  • 雑誌名: Biochemistry 37 ページ: 10991-10997
• [図書] Structure and Function of the Clostridium botulinum Serotypes C and D Toxin Complex. (2005)
  • 著者名/発表者名: Watanabe T, Sagane Y, Mutoh S, Suzuki T, Hasegawa K, Kouguchi H, Ohyama T.
  • 総ページ数: 17
  • 出版者: Research Signpost