ヘパラン硫酸鎖活性ドメインに対する阻害剤の遺伝子工学的・化学的手法による開発

2003 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 15570126
• 研究機関: 愛知医科大学
• 研究代表者: 羽渕 弘子 愛知医科大学, 分子医科学研究所, 講師 (90329821)
• キーワード: グリコサミノグリカン / ヘパラン硫酸 / ヘパラン硫酸-O-硫酸転移酵素 / 細胞増殖因子 / 硫酸化オリゴ糖 / リコンビナント酵素

研究概要

1 遺伝子工学的手法による阻害剤の開発:CHO細胞で発現、精製したリコンビナントヘパラン硫酸2-O-,6-O-硫酸転移酵素-HS2ST, HS6ST1-と活性化硫酸(PAPS)と化学的に脱硫酸化したヘパリンから調製した8糖を試験管内で反応して、硫酸オリゴ糖ライブラリーを作製した。受容体基質(ldo-8)の構造はイズロン酸-N-スルホグルコサミンユニットの4分子からなる構造をもつ。HS2STと反応するとイズロン酸の2位に硫酸基が1から3分子転移されたもの、HS6STと反応するとN-スルホグルコサミン残基の6位に硫酸基が1から3分子転移されたオリゴ糖が合成された。さらにヘパリンからイズロン酸2-硫酸とN-スルホグルコサミン6-硫酸の両方を含む8糖を得た。このようにして作製された8糖ライブラリーと様々なヘパリン結合性細胞増殖因子(FGFs, HGF, VEGF, BMPsなど9種類)との特異的な結合をアフィニティクロマトグラフィと表面プラズモン法で解析した。その結果5グループに大別された。中でもFGF-10とFGF-2は非常に特異的な構造、前者は6-O-硫酸化オリゴ糖のみ、後者は2-O-硫酸化オリゴ糖のみと結合した。この結果は、特異的なオリゴ糖によって特定の細胞増殖因子の活性を制御できる可能性を示唆した。様々な細胞増殖因子レセプターを導入した安定細胞を作製したので、今後これらオリゴ糖によるシグナル伝達への影響をレセプターのリン酸化やERKのリン酸化で調べる予定である。
2 化学的手法による阻害制の開発:上記で述べたリコンビナント酵素を用いて試験管内で酵素活性を阻害する化合物をアッセイした結果、metyl-a-GlcA2Sが阻害活性を示した。この化合物が培養細胞に作用するかどうかを合成されるヘパラン硫酸構造の変化を調べたところ、予備的であるが6-O-硫酸化が減少した。今後、上記に述べた細胞増殖因子レセプターを導入した安定細胞を用いて、シグナル伝達への阻害効果を調べる。

研究成果

• [文献書誌] Takeo S, Fujise M, Akiyama, Habuchi H, Nakato H.et al.: "In vivo hyaluronan synthesis by expression of mammalian hyaluronan synthase gene in drosophila."J Biol Chem. In press. (2004)
• [文献書誌] Ashikari-Hada S, Habuchi H.Kimata K.et al.: "Characterization of growth factor-binding structures in heparin/heparan sulfate using an octasaccharide library."J Biol Chem. In press. (2004)
• [文献書誌] Nogami K, Habuchi H, Kimata K et al.: "Distinctive expression patterns of heparan sulfate O-sulfotransferases and regional differences in heparan sulfate."J Biol Chem. 279, 9. 8210-8229 (2004)
• [文献書誌] Irie A, Habuchi H, Kimata K, Sanai Y.: "Heparan sulfate is required for bone morphogenetic protein-7 signaling."Biochem Biophys Res Commun.. 308, 4. 858-865 (2003)
• [文献書誌] 羽渕脩躬, 羽渕弘子, 木全弘治: "Molecular diversity and biological functions of proteoglycan Sulfotransferase."蛋白・核酸・酵素. 48, 8. 1010-1018 (2003)
• [文献書誌] Bink RJ, Habuchi H, Kimata K.et al.: "Heparan sulfate 6-o-sulfotransferase is essential for muscle development in zebrafish."J Biol Chem.. 273, 33. 31118-31127 (2003)
• [文献書誌] Jemth P, Habuchi H, Kimata K, Kusch-Gullberg M.: "Oligosaccharide library-based assessment of heparan sulfate 6-0-sulfotransferase substrate specificity."J Biol Chem.. 278, 27. 24371-24376 (2003)
• [文献書誌] Smeds E, Habuchi H, Kimata K, kusche-Gullberg M.et al.: "Substrate specificities of mouse heparan sulphate glucosaminyl 6-O-sulphotransferases."Biochem J. 372, 2. 371-380 (2003)
• [文献書誌] Habuchi H, Miyake G, Kiraata K.et al.: "Biosynthesis of heparan sulphate with diverse structures and Functions."Biochem J. 371, 1. 131-142 (2003)