| 研究概要 |
Caチャネルは筋肉の収縮や神経のシナプス伝達などの細胞機能に重要な役割を果たしている。本研究はCaチャネルの調節におけるカルパスタチンの作用機構とCaMの作用機構との関連を解明しようとするものである。
実験はまずモルモット心室筋細胞を用いてパッチクランプ法で行った。CaMはCSと同様にcell-free系で消失したCaチャネルの活性を再活性化したが、CSと違ってカルモジュリン依存性キナーゼ(CaMK)の阻害剤に抑えなかった。CaMの作用機構を調べるために、CaMKとの関連を検討しました。その結果、CaMの作用はCaMKの存在が必要だが、CaMKを介してCaチャネルをリン酸化したものではないことを明らかにした。CaMKの作用はCaチャネルをCaMの調節を受けられるように一定の状態を保つことで、CaMはそのようなCaチャネルしか再活性化できないことが分かった。CaMは4つのCa結合サイトを持ち、CaMの作用を詳しく調べるため、4つサイトをそれぞれDNA組み替え法で変異させ、融合蛋白として大腸菌発現で作り、その効果を調べた。その結果、CaMのC末部位はCaチャネルの基本活動を維持し、CaMのN末部位はCa依存性調節に関与することがわかりました。さらに、CaMおよびCSのCaチャネルとの結合部位をGel shift assay, pull down assay, fluorescence measurementなどの方法で調べました。その結果、CaMとCSはCaチャネルのC末の同じところに結合する可能性が高いと示唆された。
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