| 研究概要 |
Caチャネルは筋肉の収縮や神経のシナプス伝達などの細胞機能に重要な役割を果たしている。本研究はCaチャネルの調節におけるカルパスタチン(calpastatin, CS)の作用機構とカルモジュリン(calmodulin, CaM)の作用機構との関連を解明しようとするものである。2年間の研究により、下記の研究成果を得られた。
1.CSとCaMの作用にCaMKIIリン酸化の関与 CSとCaMの作用機構を調べるために、CaM依存性キナーゼII(CaMKII)との関連を検討した。その結果、CaMの作用はCaMKIIの存在が必要だが、CaMKIIを介してCaチャネルをリン酸化したものではないことを明らかにした。CaMKの作用はCaチャネルをCaMなどの調節を受けられるように一定の状態を保つことで、CaMはそのようなCaチャネルしか再活性化できないことが分かった。
2.CSの有効領域の同定 CSのCaチャネル活性化作用はドメインLにあることはこれまでの研究により明らかにされたが、この研究はCSの有効領域を更に同定した。ドメインLの短いペプチドをGST融合蛋白として大腸菌に発現させ、精製した。モルモット心室筋細胞でパッチクランプ法を用いて、それらのペプチドのCa^<2+>チャネル活動に対する作用を観察し、Ca^<2+>チャネルの活性化作用を持つペプチドをスクリーニングした。その結果、CSのCa^<2+>チャネルを活性化する有効領域はドメインLの真中部分の約11個アミノ酸からなることが分かった。
3.CSとCaMとの結合関係 CSとCaMをGST融合タンパクとして作り、互いの結合をpull down assayなどの方法で調べた。その結果、CSとCaMとはCa^<2+>依存的に直接結合することが分かった。
4.CSのCaチャネルとの結合部位 CaチャネルC末の部分ペプチドをGST融合タンパクとして作り、CSのCaチャネルとの結合部位を調べた。その結果、CSはCaチャネルC末のCaM結合部位に結合する可能性が高いと示唆された。
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