生きた細胞中でのリン酸化ミオシンII分子の局在の可視化解析

2003 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 15570161
• 研究機関: 広島大学
• 研究代表者: 小阪 敏和 広島大学, 大学院・理学研究科, 助教授 (10033903)
• 研究分担者: 佐甲 靖志 大阪大学, 大学院・医学系研究科, 助教授 (20215700)
• キーワード: 細胞運動 / 細胞分裂 / ミオシンII / リン酸化 / 調節軽鎖 / 高等動物培養細胞 / ヒーラ細胞 / 細胞骨格

研究概要

高等動物の培養細胞では、細胞分裂期に「収縮環」と呼ばれる構造が形成され、収縮環が収縮することにより細胞が二つに分裂することが明らかにされている。収縮環の局在する分裂溝には、リン酸化状態のミオシンII調節軽鎖(MRLC)を集積・局在させる機構が存在し、それにより活性化されたミオシンIIが収縮環を収縮させると考えられている。本研究では、GFPを付加した疑似リン酸化型(DD-MRLC)および非リン酸化型(AA-MRLC)の変異MRLCをHeLa細胞に導入し、導入細胞を顕微鏡で経時観察する事により、分裂期におけるMRLCの動態とリン酸化の役割について解析を行った。その結果、DD-MRLCは分裂中期以前から細胞表層に存在するが、AA-MRLCは分裂中期までは細胞質に存在し、染色体分離が起こる分裂後期以降にいずれの変異型も収縮環領域に強く集積してくる様子が観察された。そこで収縮環への局在化についてより詳細な解析を行った結果、各変異型間で収縮環に集積するタイミングに差は見られないが、局在の程度はAA-MRLCよりDD-MRLCの方が強い事が示された。また、AA-MRLCおよびDD-MRLC発現細胞では、それぞれ細胞質裂の遅延と促進が引き起されていることを明らかにした。
ミオシンII 分子はATPase活性およびフィラメント化という二つの特性を持っており、そのいずれもがMRLCのリン酸化による制御を受ける事が知られている。リン酸化によって制御を受ける分裂期ミオシンIIの挙動がいずれの影響によるものかを調べるために、ミオシンIIのATPaseに対する特異的阻害剤であるブレビスタチンで処理した細胞での各変異型MRLCの局在を観察した。その結果、ミオシンIIのATPaseを阻害した場合でも、いずれの変異型MRLCも収縮環への集積が観察されたが、その局在の程度はDD-MRLCの方が強い事が確かめられた。これらの結果から、ミオシンIIの収縮環への集積にはMRLCのリン酸化により誘導されるミオシンIIの繊維化が重要である事が示された。また今回、ブレビスタチン処理後の分裂期細胞では収縮環への強い集積の一方で分裂極側の表層のミオシンIIの局在が著しく減少している様子が観察された。これらの事実から、細胞分裂期において細胞表層の各領域を含む細胞全体のミオシンIIの局在が動的に制御されている事が示唆された。

研究成果

• [文献書誌] Nakamura Himi E., Hosoya H., Kosaka T., Hosoya N.: "improved method for coupling of DNase I to a crosslinked agarose gel bead"Tiss Calt.Res.Commun. 22. 85-88 (2003)
• [文献書誌] Kuo J.C., Lin J.R., Staddon J.M., Hosoya H., Chen R.H.: "Uncoordinated regulation of stress fibers and focal adhesions by DAP kinase"J.Cell Sci.. 116. 4777-4790 (2003)
• [文献書誌] Ishikawa Y., Tokumitsu H., Inuzuka H, Murata-Hori M., Hosoya H, Kobayashi R.: "Identification and characterization of novel components of a Ca<2+>/calmodulin-dependent protein kinase cascade in HeLa cells"FEBS Lett.. 550. 57-63 (2003)
• [文献書誌] Ueda K., Ohta Y., Hosoya H.: "The carboxy-terminal pleckstrin homology domain of ROCK interacts with filamin-A"Biochem.Biophys.Res.Commun.. 301(4). 886-890 (2003)
• [文献書誌] Komaba S., Inoue A., Murata S., Hosoya H., Ikebe M.: "Determination of human myosin III as a motor protein having a protein Kinase activity"J.Biol Chem.. 278(24). 21352-21360 (2003)
• [文献書誌] Fumoto K., Uchimura T., Iwasaki T., Ueda K., Hosoya H.: "Phosphorylation of myosin II regulatory light chain is necessary for migration of HeLa cells but not for localization of myosin II at the leading edge"Biochem.J.. 370. 551-556 (2003)