ゴルジ体の構造形成因子の同定と機能解析

2003 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 15570167
• 研究機関: 福岡大学
• 研究代表者: 池原 征夫 福岡大学, 医学部, 教授 (70037612)
• 研究分担者: 相田 美和 福岡大学, 医学部, 助手 (20258528) ; 藤原 俊幸 福岡大学, 医学部, 講師 (80190099)
• キーワード: ゴルジ体局在タンパク質 / Giantin / GCP170 / GCP60 / GCP16 / アシル化 / ゴルジ膜結合様式

研究概要

これまでの研究で、ゴルジ体の細胞質側に局在するタンパク質としてGiantinおよびGCP170を同定し、小胞体-ゴルジ体間のタンパク質輸送およびゴルジ体の構造形成に関与していることを明らかにした。今年度は、Giantinと特異的に結合する新規タンパク質としてGCP60を、また、GCP170と特異的に結合するタンパク質としてGCP16を同定し、それぞれのタンパク質同士の結合様式ならびにゴルジ膜との結合様式について検討した。
1)GCP60のゴルジ体局在化シグナルの決定とGiantinとの結合様式。
GCP60のゴルジ体への局在化にはC末端側半分(373-528)の領域が必須である。各種の置換変異体および欠失変異体を作成し、HeLa細胞に導入・発現させ、ゴルジ体局在化シグナルを解析した。その結果、GCO60のゴルジ体局在化にはC末端近くのチロシン2残基(Tyr^<521>/Tyr^<522>)が必須であることがわかった。一方、N末端近くのフェニールアラニン2残基(Phe^<93>/Phe^<94>)をアラニンに置換するとGCP60は小胞体に停留し、ゴルジ体に局在しなくなった。これらの結果から、GCP60はまずN末端のPhe^<93>/Phe^<94>が小胞体からの輸送シグナルとして働き、さらにC末端のTyr^<521>/Tyr^<522>がGiantinとの結合ならびにゴルジ体への局在に必須であることが示唆された。
2)GCP16のゴルジ膜結合様式およびGCP170との結合様式。
GCP16は膜貫通領域を持たないにもかかわらずゴルジ膜に強固に結合している。まず、[^3H]パルミチン酸のラベル実験でGCP16が脂質を介してゴルジ膜に結合していることを確認した。本タンパク質にはシステインが4残基含まれているが、そのうち実際にアシル化されるのはCys^<69>とCys^<72>であることを明らかにした。この2残基をアラニンに置換すると、GCP16はアシル化されず可溶性タンパク質となり、ゴルジ体に局在しなくなることがわかった。さらに、免疫沈降反応の解析より、GCP16のアシル化はGCP170との結合にも必須であることが確認された。

研究成果

• [文献書誌] E.Ohta et al.: "Identification and characterization of a novel acylated Golgi protein, GCP16 that interacts with GCP170"Journal of Biological Chemistry. 278,51. 51957-51967 (2003)
• [文献書誌] A.Ito et al.: "Localization of the PP2A B56 regulatrory subunit to the Golgi complex : possible role in vesicle transport and migration"American Journal of Pathology. 162,2. 479-489 (2003)
• [文献書誌] T.Fujiwara et al.: "Direct interaction of the Golgi membrane with the endoplasmic reticulum membren caused by nordihydroguaiaretic acid"Biochemical and Biophysical Research Communication. 301,4. 927-933 (2003)
• [文献書誌] K.Fukushima et al.: "A β-N-acetylglucosaminyl phosphate diester residueis attached to the GPI anchor of human placental alkaline phosphatase"Journal of Biological Chemistry. 278,38. 36296-36303 (2003)
• [文献書誌] M.S.Nadal et al.: "The CD26-related dipeptidyl aminopeptidase-like protein DPPX is a critical component of neuronal A-type K+ channels"Neuron. 37,3. 449-461 (2003)
• [文献書誌] K.Ohkubo et al.: "Inhibitory effect of α1-antitrypsin Pittsburgh-type mutant on proinsulin processing in the regulated secretory pPathway of the pancreatic β-Cell line MIN6."Endocrine Journal. 50,1. 9-20 (2003)