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研究代表者はこれまでにペスチウイルス属に含まれるすべてのウイルス種を一括して検出するために超高感度なネステッドRT-PCR法を開発してきた。今年度は、わが国において患畜や細胞培養から分離されたペスチウイルス株を対象に、(1)現有のサーマルサイクラーを用いて申請者が開発したRT-PCR法により、ウイルスゲノムの5'端非翻訳領域を増幅させ、その塩基配列を決定するとともに、(2)リアルタイムPCRを並行して行い、ウイルスの定量を試みた。通常のRT-PCRには、はじめに供試ウイルスサンプルからグアニジン・イソチオシアネート法によりRNAを抽出し、ペスチウイルスのゲノムRNAの5'端非翻訳領域の下流に位置するプライマーを用いてcDNAのファーストストランドをM-MLV逆転写酵素により、現有の恒温槽内で合成した。得られた1本鎖のcDNAを基質として、逆転写反応に用いた下流のプライマーとその上流に位置するプライマーを用いて、PCRを現有のサーマルサイクラーで行った。これにより5'端非翻訳領域からは約300塩基対の大きさのPCR産物がそれぞれ得られた。PCR産物は現有の装置を用いてアガロースゲル電気泳動により分画し、紫外線トランスイルミネータにより観察した。得られたPCR産物を現有のDNAシークエンサを駆使して、ダイデオキシ法によりその塩基配列を決定した。さらに、得られた塩基配列をCLUSTAL等のコンピュータプログラムにより解析して、ペスチウイルスの系統解析を行った。また、リアルタイムPCRでは蛍光色素SYBR Greenを用いたインターカーレーター法により、短時間で定量的な結果を得ることを目標に省力化を試みた。これらの解析により、病歴の明らかな個体から分離されたウイルス株や細胞変性効果の判明しているウイルス株の遺伝学的型別が可能となった。
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