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DNA二本鎖切断(DSB)をはじめとするDNA傷害に対する修復過程について、Xenopus卵抽出液を用いた無細胞実験系により解析することを目的とした。とくに本年度は、RecQヘリカーゼファミリーに属するRothmund-Thomson症候群原因遺伝子産物(RecQL4)を中心に解析をおこなった。これまでの解析より、RecQL4がDSBに伴ってクロマチン上に結合することはすでに確認されており、RecQL4が何らかの形でDSBに対する応答反応に関わることが予想された。そこで、まず、卵抽出液中のDNA二本鎖切断修復活性を定量的に解析するため、プラスミドDNAを基質に用いた相同組換え修復(HRR)活性および非相同末端結合修復(NHEJ)活性の測定系を構築した。本測定系を用いた結果、NHEJによって得られる産物はHRRによって得られるプラスミドの生産効率に比べて、約1000倍の高い効率で産生されること、検出されたNHEJ活性はDNA polymerase α、δ、εの阻害剤であるaphidicolin、DNA-dependent protein kinaseの阻害剤であるwortmanninによって部分的に阻害されること、HRR活性はaphidicolinによって効率よく阻害されることが確認された。本測定系を用いてRecQL4のDSB修復への関与を検討したところ、RecQL4を除去した卵抽出液においてNHEJ活性の顕著な抑制とHRR活性の有意な促進が確認された。組換えタンパク質として入手可能なヒトRecQL4をRecQL4除去卵抽出液に添加したが、これらの活性の回復は認められなかった。しかしながら、RecQL4を除去していない卵抽出液にさらにヒトRecQL4を添加した場合に、NHEJ活性の顕著な増強が確認された。以上の結果より、RecQL4がNHEJに促進的に、HRRに抑制的に寄与することによりDSB修復に積極的に関与することが示唆された。
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