テロメラーゼ活性を誘導または抑制する新規因子の探索

2003 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 15590061
• 研究機関: 広島大学
• 研究代表者: 田原 栄俊 広島大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 助教授 (00271065)
• キーワード: テロメラーゼ / テロメア / 制ガン剤 / hTERT / がん細胞 / セルソーター / GFP / cDNA

研究概要

テロメラーゼを抑制あるいは誘導する因子をスクリーニングする目的で、テロメラーゼの触媒サブユニットのhTERT遺伝子のプロモーターにGFP(緑色蛍光遺伝子)をつなげたコンストラクトを作成した。これを、テロメラーゼ活性があるがん細胞RKOに導入し、緑色蛍光がある細胞(hTERTが活性化している細胞)をセルソーターによって単離し、細胞一個単位でhTERTの転写活性をモニターできる細胞を樹立した。同様の手法により、hTERT遺伝子を導入してテロメラーゼ活性をもち不死化した正常繊維芽細胞NHF-hTERTにhTERTプロモーター-GFPのコンストラクトを導入した。この細胞では、内因性のhTERTの発現はきわめて低いので緑色蛍光を全く見られなかった。hTERTの転写抑制因子MeninのsiRNAを細胞に処理すると、NHF-hTERTモニター細胞で緑色蛍光が見られたことから、hTERTの発現を誘導する因子をスクリーニングするよいモニター細胞の樹立ができた。RKO細胞のhTERTモニター細胞を用いた実験では、モニター細胞に正常細胞のcDNAライブラリー(hTERTを抑制する遺伝子が含まれている)を導入して緑色蛍光が低下した細胞をセルソーターを用いて、20個づつ24穴マルチウエルプレート10枚に集めた。これらの細胞を増やして、DNAを単離し、PCRによって導入したcDNAを回収した。現在これらのcDNAクローンの二次スクリーニング、塩基配列の決定を行い、hTERTの転写を抑制する因子を絞り込んでいる。

研究成果

• [文献書誌] Masanobu SUGIMOTO^1, Hidetoshi TAHARA^2, Toshinori IDE^2, Yasuhiro FURUICHI^1: "Steps involved in immortalization and tumorigen es in human B-lymphoblas toid cell lines transformed by Epstein-Barr virus"Cancer Research. (In press). (2004)
• [文献書誌] Takahashi, T., Kawabe, T., Okazaki, Y., Itoh, C., Noda, K., Tajima, M., Satoh, M., Goto, M., Mitsui, Y., Tahara, H., Ide, T., Furuichi, Y., Sugimoto, M.: "In vitro establishment of tumorigenic human B-lymphoblastoid cell lines transformed by Epstein-Barr virus"DNA Cell Biol.. 22. 727-735 (2003)