| 研究概要 |
(1)apo-NCSにおけるクロモホア結合に関わるアミノ酸側鎖を探る目的で、apo-NCSのクロモホア結合ポケットの入り口部分に位置するアミノ酸であるSer98をそれぞれAla、Cys、Gly、Thrに置換したapo-NCSアミノ酸置換体を作製した。(2)蛍光法によるapo-NCS簡易評価系を用いて、擬似クロモホアであるEtdBrとapo-NCS変異体との結合能を評価した結果、よりクロモホアとの結合活性の高いapo-NCSアミノ酸置換体(S98G)が得られ、apo-NCSを基本骨格とした超天然型apo-NCSの創製に期待がもたれた。(3)Megaprimer PCR mutagenesis法、overlap extension PCR mutagenesis法を用い、apo-NCSのクロモホア結合に関与すると思われる、領域A(49-52,PADF)、領域B(76-80,FLFDG)、領域C(94-98,QVGLS)の14アミノ酸側鎖のランダム化apo-NCS変異体遺伝子ライブラリーを作製した。(4)Megaprimer PCR mutagenesis法、overlap extension PCR mutagenesis法にdammethylation/DpnI digestionを組み合わせ、よりランダム変異導入効率のよいランダム化apo-NCS変異体遺伝子ライブラリーの作製に成功した。(5)ランダム化apo-NCS変異体遺伝子ライブラリーを用い、ファージディスプレイ法にてGA反応性apo-NCS変異体を単離・選別した結果、GA反応性が付加されたクローンC5-32、C5-37、C5-38、C5-41、C5-54を得た。
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