| 研究課題/領域番号 |
15590150
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| 研究機関 | 国立医薬品食品衛生研究所 |
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研究代表者 |
内田 恵理子 国立医薬品食品衛生研究所, 遺伝子細胞医薬部, 室長 (80176685)
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| 研究分担者 |
石井 明子 国立医薬品食品衛生研究所, 生物薬品部, 主任研究官 (50291117)
山口 照英 国立医薬品食品衛生研究所, 遺伝子細胞医薬部, 部長 (50111117)
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| キーワード | 遺伝子治療 / アデノウイルスベクター / レトロウイルスベクター / 増殖性アデノウイルス / 増殖性レトロウイルス / ガラスビーズ / ポリエチレンイミン磁気ビーズ |
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| 研究概要 |
ウイルスベクター製造過程で混入する可能性のある増殖性ウイルスの検出は、遺伝子治療用ウイルスベクターの品質、安全性確保上重要な課題である。本研究ではウイルスベクターに混入する増殖性アデノウイルス(RCA)及び増殖性レトロウイルス(RCR)を、ウイルスの指向性細胞への感染性とリアルタイム定量PCRの迅速性、高感度性、定量性を組合わせたInfectivity PCR法により検出する方法の開発を検討した。
感染性のRCAの検出は、HeLa細胞に感染させた後、細胞内で増幅したRCAのゲノムDNAをリアルタイム定量的PCRにより高感度に検出する手法を開発した。すなわち、細胞内に増幅したRCAを測定することで上清中のRCAを測定するよりも高感度にRCAを検出可能であり、また細胞内のウイルスゲノムDNAは新たに開発したガラスビーズ法により簡便で効率よく抽出可能であることが判明した。Infectivity PCR法にガラスビーズ抽出を組合せることで、10^9 particlesのアデノウイルスベクターにスパイクした1pfuのRCAを感染3日目で検出可能であり、従来のRCA検出法の細胞変性効果(9日目で10,000pfuを検出)と比較して迅速・高感度にRCAを検出可能であることを明らかにした。
感染性RCRの検出は、M.dunni細胞に感染させた後、RCRのゲノムRNAを抽出し、リアルタイム定量的RT-PCRにより高感度に検出する手法を開発した。すなわち上清中に得られるRCRのポリエチレンイミン磁気ビーズ濃縮とInfectivity RT-PCR法の組合わせにより、従来のフォーカスアッセイより、迅速、高感度にRCRの検出が可能であること、また上清でさまなく細胞内のウイルスRNAをガラスビーズで抽出する方法とInfectivity RT-PCR法を組合わせるとさらに高感度化が可能であることを明らかにした。
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