| 研究課題/領域番号 |
15590150
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
医療系薬学
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| 研究機関 | 国立医薬品食品衛生研究所 |
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研究代表者 |
内田 恵理子 国立医薬品食品衛生研究所, 遺伝子細胞医薬部, 室長 (80176685)
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| 研究分担者 |
山口 照英 国立医薬品食品衛生研究所, 遺伝子細胞医薬部, 部長 (50111117)
永田 龍二 国立医薬品食品衛生研究所, 遺伝子細胞医薬部, 主任研究官 (20370942)
石井 明子 (渡部 明子) 国立医薬品食品衛生研究所, 生物薬品部, 室長 (50291117)
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| 研究期間 (年度) |
2003 – 2004
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| キーワード | 遺伝子治療 / レトロウイルスベクター / アデノウイルスベクター / 増殖性レトロウイルス / 増殖性アデノウイルス / 感染性PCR / ウイルス検出 / ポリエチレンイミン |
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| 研究概要 |
ウイルスベクターの製造過程で混入する可能性のある増殖性ウイルスの検出は、遺伝子治療用ウイルスベクターの品質、安全性確保上重要な課題である。本研究ではウイルスベクターに混入する増殖性アデノウイルス(RCA)及び増殖性レトロウイルス(RCR)を、ウイルスの指向性細胞への感染性とリアルタイム定量PCRの迅速性、高感度性、定量性を組み合わせた感染性(R7-)PCR法により検出する方法を開発した。
RCAは、HeLa細胞に感染させ、一定期間増幅後、細胞中のRCAのゲノムDNAをガラスビーズ法により簡便で効率よく抽出し、リアルタイム定量PCRで測定する感染性PCR法を確立した。感染性PCR法では、10^9 particlesのアデノウイルスベクターにスパイクした1pfuのRCAを感染3日目で検出可能であり、従来法の細胞変性効果(9日目で10,000pfuを検出)による検出と比較して、より短時間の培養で10,000倍も高感度にRCAを検出可能であることを明らかにした。
RCRは、M.dunni細胞に感染させ、一定期間増幅後、上清中のRCRをポリエチレンイミン(PEI)結合磁気ビーズで濃縮し、ビーズ画分からRCRのゲノムRNAを抽出してリアルタイム定量RT-PCRで測定する感染性RT-PCR法を確立した。感染性RT-PCR法では、従来法のフォーカスアッセイと比較してより短時間の培養で10倍以上高感度にRCRを検出可能であった。また、上清中のRCRの替わりに細胞内に増幅したウイルスRNAをガラスビーズ法で抽出後に測定すると、より短時間の培養でウイルス検出が可能であった。さらに、RCRをPEI磁気ビーズと混合後に磁場の上で強制感染させる高効率ウイルス感染系を確立した。この感染系を利用して感染性RT-PCR法を行うと、さらに10倍以上高感度にRCRを検出できることを明らかにした。
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