| 研究課題/領域番号 |
15590185
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
石井 孝広 京都大学, 医学研究科, 助手 (40303812)
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| 研究分担者 |
鷹野 誠 京都大学, 医学研究科, 講師 (30236252)
古谷野 好 京都大学, 医学研究科, 助教授 (50183041)
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| キーワード | 過分極 / チャネル / Ih / HCN / 相同組換え / テトラサイクリン |
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| 研究概要 |
過分極で活性化する陽イオンチャネルのサブタイプの一つで心臓や視床で周期的発火に重要であることが示唆されているHCN4の生体内、特に心臓の洞房結節および視床の神経細胞における役割を解明するため、HCN4の発現がテトラサイクリンあるいはその誘導体を投与することによって調節することが出来る遺伝子改変マウスを作製する目的で実験を行った。HCN4の5'非翻訳領域に大腸菌テトラサイクリン耐性オペロンの転写調節に働くタンパク質とオペレーター配列を利用したいわゆるTet-Offシステムを相同組換えで挿入すると、HCN4の本来のプロモーターでTetリプレッサータンパクがつくられ、そのタンパクがHCN4の開始コドンのすぐ上流に挿入されたTetオペレーター配列に結合しHCN4が発現する予定である。この相同組換えを起こすためのターゲティングベクターをプラスミドで構築しマウスのES細胞にトランスフェクションを行い、相同組換えを起こしたES細胞を得、サザーンブロッティングで確認した。その細胞をマウス初期杯に導入しキメラマウスの作製に成功した。それらをかけあわせて現在、ヘテロに遺伝子が改変されたマウスを得ている。今後さらにそれらのマウスをかけあわせてホモマウスを得、予定通りテトラサイクリンの投与によってHCN4の発現が抑制されるかをPCR法、ウェスタンブロッティング法を用いてmRNAおよびタンパクレベルで確認する予定である。
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