血管平滑筋の形質変換における筋線維の安定化と消失の機構の解明

2004 年度 研究成果報告書概要

• 研究課題/領域番号: 15590224
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 薬理学一般
• 研究機関: 三重大学
• 研究代表者: 岡垣 壮 三重大学, 生物資源学部, 助教授 (80185412)
• 研究分担者: 大井 淳史 三重大学, 生物資源学部, 助手 (70203693) ; 中村 彰男 群馬大学, 大学院・医学研究科, 講師 (30282388)
• 研究期間 (年度): 2003 – 2004
• キーワード: 蛋白質 / 薬理学 / ミオシン / 細胞・組織 / 動脈硬化症 / 循環器・高血圧 / 脳神経疾患

研究概要

培養平滑筋細胞株AC01株を利用して血管平滑筋の形質変換後の細胞骨格系蛋白質の発現の時間変化を追跡した。この細胞株をPDGF存在下で培養すると形質変換に類似した状態になり、あるいはNaB存在下で培養しするとより分化の進んだ状態になる。それぞれの細胞からmRNAを単離してcDNAを合成した。RT-PCRにより、PDGF処理細胞ではα-アクチンおよび高分子量カルデスモンの発現量が減少することを確認した。逆にNaBで処理した細胞では発現量が有意に増加していた。またこれらの実験によって得られたcDNAを利用してサブトラクションライブラリーを作成することにした(後述)。
ミオシン調節蛋白質p32の細胞内での動態を調べるため、シグナル配列に対する抗体で上記の細胞を染色したところ、細胞骨格が強く染色された。また抗p32mat抗体をもちいたウェスタンブロッティングの結果によると細胞骨格に存在するp32は分子量が42kDaのもの(p32FL)が大部分で38kDa(p32mat)のものは少なかった。このことから細胞質のミオシン線維上ではp32はシグナル配列をもって機能していると考えられる。しかし大腸菌で発現したp32FLはミオシンとは全く結合しないことから、細胞質中でp32が何らかの修飾を受けていることが示唆された。
形質変換特異的遺伝子を検索するため、PCR selectによりサブトラクションライブラリーの作成をおこなった。PDGF存在下で培養した細胞より得られたcDNAをテスターとし、NaB存在下で培養した細胞より得られたcDNAドライバーとしてサブトラクションをおこない共通する遺伝子をハイブリダイズさせた。この操作を行ったcDNAをサブクローニングしてプラスミドライブラリーを作成した。

研究成果

• [雑誌論文] A calmodulin-dependent protein kinase from lower eukaryote Physarum polycephalum. (2005)
  • 著者名/発表者名: Nakamura, A., Hanyuda, Y., Okagaki, T., Takagi T, Kohama, K.
  • 雑誌名: Biochem.Biophys.Res.Commun. 328 ページ: 838-844
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Analyses of expression and localization of two mammalian-type trans glutaminases in Physarum polycephalum, an acellular slime mold (2004)
  • 著者名/発表者名: Wada F, Ogawa A, Hanai Y, Nakamura A, Maki M, Hitomi K.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem 136 ページ: 665-672
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] A calmodulin-dependent protein kinase from lower eukaryote Physarum polycephalum (2004)
  • 著者名/発表者名: Nakamura, A., Hanyuda, Y., Okaga, T., Takagi T, Kohama, K.
  • 雑誌名: Biochem.Biophys.Res.Commun. 328 ページ: 838-844
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Analyses of expression and localization of two mammalian-type transglutaminases in Physarum polycephalum, an acellular slime mold. (2004)
  • 著者名/発表者名: Wada F, Ogawa A, Hanai Y, Nakamura A, Maki M, Hitomi K.
  • 雑誌名: J.Biochem. 136 ページ: 665-672
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Partial specific volume and adiabatic compressibility of G-Actin depend on the bound nucleotide. (2003)
  • 著者名/発表者名: Kikumoto, M., Tamura, Y., Ooi, A., Mihashi, K.
  • 雑誌名: J.Biochem. 133 ページ: 687-691
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Localization and characterization of the inhibitory Ca2+-binding site of Physarum polycephalum myosin II. (2003)
  • 著者名/発表者名: Farkas L, Malnasi-Csizmadia A, Nakamura A, Kohama K, Nyitray L.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem 278 ページ: 27399-27405
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Myosin light chain kinase stimulates smooth muscle myosin ATPase activity by binding to the myosin heads without phosphorylating the myosin light chain. (2003)
  • 著者名/発表者名: Gao Y, Kawano K, Yoshiyama S, Kawamichi H, Wang X, Nakamura A, Kohama K.
  • 雑誌名: Biochem.Biophys.Res.Commun. 305 ページ: 16-21
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Metal-free and Ca2+-bound structures of a multidomain EF-hand protein, CBP40, from the lower eukaryote Physarum polycephalum. (2003)
  • 著者名/発表者名: Iwasaki W, Sasaki H, Nakamura A, Kohama K, Tanokura M.
  • 雑誌名: Structure 11 ページ: 75-85
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Localization and characterization of the inhibitory Ca2+-binding site of Physarum polycephalum myosin II. (2003)
  • 著者名/発表者名: Farkas L, Malnasi-Csizmadia A, Nakamura A, Kohama K, Nyitray L.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 278 ページ: 27399-27405
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Biochemical properties of ordinary and dark muscle myosin from carp skeletal muscle
  • 著者名/発表者名: Okagaki, T., Takami, M., Hosokawa, K., Yano, M., Higashi-Fujime, S., Ooi, A.
  • 雑誌名: J.Biochem. (on revision)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Biochemical properties of ordinary and dark muscle myosin from carp skeletal muscle.
  • 著者名/発表者名: Okagaki, T., Takami, M., Hosokawa, K., Yano, M., Higashi-Fujime, S., Ooi, A.
  • 雑誌名: J.Biochem., (on revision)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より